癌痛是临床上常见的慢性病理性疼痛,严重影响患者的日常生活。骨癌痛则是最常见的癌痛之一,骨癌痛不仅发生于原发性骨癌,同样也可发生于骨转移的继发性骨癌。约1/3的晚期癌症病人都可能发生骨转移,骨转移也被认为是癌症引起疼痛最常见的原因。尽管世界卫生组织(WHO)倡导的癌痛三级阶梯疗法(根据疼痛的程度不同给予非甾体抗炎镇痛药和/或阿片类药物治疗),在癌痛的治疗中具有指导性意义并取得了一定成效,但由于各种药物疗法引起的免疫抑制、胃肠道反应、耐受成瘾,以及因个体差异出现的部分患者的癌痛对这些疗法不敏感等因素,以至仍有约50%癌痛患者得不到有效控制。因此,研究癌痛机理、寻求有效的控制癌痛的方法仍然是慢性痛研究领域的热点之一。 癌痛时,最突出的现象是脊髓背角内的星形胶质细胞大量增生与活化,胶质细胞活化后分泌的一系列细胞因子和生长因子改变了神经元周围的神经化学微环境,形成中枢敏化,加剧疼痛。有研究表明,抑制胶质细胞的活化能够起到镇痛作用,说明胶质细胞的活化在细胞水平参与了癌痛的发生。然而,脊髓背角的胶质细胞是如何活化的?是什么因素激活了这些胶质细胞?是值得研究的问题。 Toll样受体(Toll-like receptor, TLR,因编码基因与果蝇体内的Toll基因相似而得名),是存在于单核/巨噬细胞、自然杀伤细胞和中性粒细胞表面的一种膜受体。中枢神经系统内的To11样受体2和4(TLR2、TLR4)表达于星形胶质细胞和小胶质细胞表面,能够参与胶质细胞的激活过程,引起炎性细胞因子释放,介导疼痛的产生。那么,TLR是否与癌痛时胶质细胞的激活有关?TLR在癌痛发生发展过程起怎样作用?抑制TLR信号转导通路能否缓解癌痛?等等问题,有待研究。 热休克蛋白(heat shock protein, HSP)是TLR信号转导通路中最重要的内源性配体信号。已知,HSP60能通过TLR4诱导天然免疫系统发生促炎症反应,也可以通过TLR的介导使NF-κB, P38MAPK激活,参与信号转导过程。有研究显示,中枢神经系统损伤时,HSP表达升高,表明TLR信号通路传导增强,暗示其促炎反应加强。然而,在骨癌痛时,脊髓背角的HSP有何变化?它是否参与了TLR介导的胶质细胞的活化?目前尚不明确。 祖国医学向来重视对癌痛的认识与调治。中医认为癌痛是由气机失调,瘀血阻滞,痰凝积结,湿邪内阻,毒火结聚,虚衰失调等引起经络不通所致。针刺则能够通经络,调气血。大量临床实践证实,针刺疗法对急、慢性痛都有明显的镇痛作用。不少临床研究报道表明,针刺疗法能有效地缓解癌痛。不过目前已有报道的实验设计尚存不足,本实验通过选取多个针刺穴位、不同电针参数,在癌痛的不同时程给予癌痛动物电针治疗等,可以弥补以前的不足,有利于评价电针治疗在癌痛中的作用。 根据上述分析和提出的疑问,本论文进行了下列研究: 参照实验室前期工作,通过胫骨骨髓腔注入肿瘤细胞,建立了大鼠胫骨癌痛模型,检测模型动物的体重、胫骨的大体形态和组织病理变化、后肢机械性痛觉超敏等指标,对动物模型进行了综合评估。运用RT-PCR、 ELISA等分子生物学技术,检测癌痛大鼠模型脊髓背角TLR和HSP的表达变化;鞘内(脊膜腔内)给予Naloxone(纳洛酮,阿片受体阻断剂)和LPS-RS(TLR4外源性配体LPS的类似物)阻断TLR4传导通路,用von-Frey纤维毛测定Naloxone和LPS-RS对癌痛大鼠机械性痛觉超敏的影响;鞘内给予Naloxone和LPS-RS后,取大鼠脊髓腰膨大部位,以RT-PCR检测脊髓背角炎性细胞因子rnRNA表达。以求从不同角度认识脊髓背角TLR在癌痛中的作用。 本研究还探讨了不同电针参数对胫骨癌痛机械性痛觉超敏的影响:(1)单次电针对大鼠胫骨癌痛时机械性痛觉超敏的影响;(2)累加电针对大鼠胫骨癌痛时机械性痛觉超敏的影响。 实验结果如下: 1.大鼠胫骨癌痛模型建立 实验采用微量进样器直接穿刺向Wistar大鼠胫骨骨髓腔内接种Walker256乳腺癌细胞,建立大鼠胫骨癌痛模型。Wistar大鼠被随机分成四组:正常组(不做任何处理)、PBS组(胫骨内注入PBS)、热灭活肿瘤细胞组(胫骨内注入热灭活的肿瘤细胞)、肿瘤细胞组(胫骨内注射4×105Walker256乳腺癌细胞)。 与正常组、PBS和热灭活肿瘤细胞组大鼠相比,随着肿瘤细胞生长,肿瘤组大鼠胫骨逐出现空洞,骨表面粗糙不平,骨质明显破坏;HE染色切片可见明显的肿瘤生长、骨质破坏以及新生骨形成。大鼠接种肿瘤细胞后,体重逐渐下降,接种侧后肢逐渐产生机械性痛觉超敏,疼痛行为随时间及骨破坏的加重而加重。这些实验结果表明大鼠胫骨癌痛模型建立成功。 2. TLR/HSP在大鼠胫骨癌痛中的作用 2.1大鼠胫骨癌痛时脊髓背角TLR4表达变化 用RT-PCR方法检测了正常组、PBS组、热灭活肿瘤细胞组、肿瘤细胞组(处理方法同前)各组大鼠胫骨癌痛时脊髓背角TLR2、3、4的表达变化。结果显示,与正常组大鼠相比,肿瘤细胞组大鼠双侧脊髓背角TLR4mRNA在建模后第8天开始随着肿瘤生长逐渐增高。接种肿瘤细胞后第16天,双侧脊髓背角TLR4mRNA显著增高(p<0.01)。PBS组、热灭活肿瘤细胞组大鼠与正常组大鼠相比TLR4mRNA的表达无显著改变。 2.2大鼠胫骨癌痛时脊髓背角HSP的表达变化 用ELISA方法检测了正常组、PBS组、肿瘤细胞组大鼠胫骨癌痛时脊髓背角HSP60、70的变化。结果显示,与正常组大鼠相比,大鼠胫骨接种肿瘤细胞后第8天,双侧脊髓背角的HSP60的表达开始增高,16天显著增高。PBS组与正常组大鼠相比无显著改变。 2.3Naloxone抑制TLR4信号通路后,对大鼠胫骨癌痛时机械性痛觉超敏的影响 Naloxone能与TLR4结合而抑制TLR信号通路的传导。本实验对胫骨内注入Walker256乳腺癌细胞的大鼠,或不作任何处理,或鞘内(脊膜腔内)注入Naloxone (60μg/20μl)或生理盐水,分别形成单纯模型组、Naloxone组、生理盐水组,鞘内注射于建模后第8、12、16天实施,注射后45、90、135、180min时,测定大鼠后肢机械性痛觉超敏变化。结果显示,在癌痛第8天、12天时给予鞘内注射Naloxone阻断TLR4信号通路能明显缓解胫骨癌痛时的机械性痛觉超敏(p<0.05);癌痛16天时Naloxone组与生理盐水组的机械性痛阈未见明显差异。提示通过Naloxone抑制TLR信号通路能在癌痛前期缓解机械性痛觉超敏。 2.4LPS-RS竞争结合TLR4后对大鼠胫骨癌痛时机械性痛觉超敏的影响 由于作为TLR4外源性配体类似物的LPS-RS,能与TLR4结合后能竞争性抑制TLR4与其它配体的结合,阻断其信号传导,因此,本文设计了LPS-RS用药后,验证TLR4作用的实验。本实验对胫骨内注入Walker256乳腺癌细胞的动物,或不作任何处理,或鞘内(脊膜腔内)注入LPS-RS(20μtg/20μl)或生理盐水,分别形成单纯模型组、LPS-RS组、生理盐水组,鞘内注射于建模后第8、12、16天实施,注射后45、90、135、180min时测定大鼠后肢机械性痛觉超敏。结果显示,在癌痛第8天、12天时给予鞘内注射LPS-RS能明显缓解胫骨癌痛时的机械性痛觉超敏;癌痛16天时LPS-RS组与生理盐水组的机械性痛阈未见明显差异。说明LPS-RS能在癌痛前期缓解机械性痛觉超敏。 2.5Naloxone阻断TLR4信号通路对大鼠脊髓背角炎性细胞因子表达的影响 本实验室以往工作显示,癌痛时大鼠脊髓背角炎性细胞因子表达增高。那么,若抑制TLR4信号通路,是否能够降低炎性细胞因子的表达?本实验按2.3中所述方法将大鼠分为单纯模型组、Naloxone组、生理盐水组,于建模后第8、12天分别给予鞘内注射Naloxone或生理盐水,90min后处死动物,取脊髓背角,用RT-PCR法检测了脊髓背角炎性细胞因子白介素-1p(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达变化。结果显示,与模型组相比,第12天时,Naloxone显著降低了脊髓背角IL-1β、TNF-α mRNA表达,而生理盐水对炎性细胞因子mRNA表达无明显作用。 小结:本实验观测到癌痛大鼠双侧脊髓背角TLR4表达增多,HSP60含量提高;通过Naloxone或LPS-RS抑制TLR4信号传导通路,可缓解癌痛时大鼠机械性痛觉超敏,降低脊髓炎性因子mRNA表达,提示阻断TLR4信号转导,可抑制胶质细胞的激活,也就是说,脊髓胶质细胞的激活可能是通过TLR4信号传导通路而完成。而HSP60在TLR4信号传导路中所起的作用还需要进一步的研究。 3.电针对癌痛的作用 3.1单次电针对大鼠胫骨癌痛时机械性痛觉超敏的影响 实验采用配伍选穴,对大鼠对侧“足三里/昆仑”和“足三里/环跳”作电针刺激观察。于建模后第6日(癌痛早期))和第16日(癌痛晚期)通过韩氏电针治疗仪给予“连续波”(频率15Hz)刺激,强度2-5mA(以出现后肢肌肉轻微抖动,而动物不嘶叫为宜),电针治疗时间为30分钟。测定电针后15、30、45、60、120main时大鼠后肢机械性痛觉超敏。结果显示,在癌痛的早期或晚期给予单次电针治疗,电针组与模型组大鼠机械性痛觉超敏均无显著性差异,说明单次电针不能效缓解胫骨癌痛时的机械性痛觉超敏。 3.2多次电针对大鼠胫骨癌痛时机械性痛觉超敏的影响 同样采用配伍取穴,实验分别对大鼠对侧“足三里/环跳”穴于建模后第6-16天内用韩氏电针治疗仪给予“连续波”(频率15HZ)或疏密波(2/100HZ)刺激,强度同上(2-5mA),电针治疗时间为30分钟。随后测定大鼠后肢机械性痛觉超敏的变化。结果显示,癌痛时给予多次电针治疗后,电针组与模型组的机械性痛觉超敏均无显著性差异,说明累加电针同样不能有效缓解胫骨癌痛时的机械性痛觉超敏。 小结:通过不同穴位配伍、不同频率、不同时间点的电针治疗,发现电针对于胫骨癌痛引起的机械性痛觉超敏没有明显的缓解作用,提示电针镇痛具有局限性。 综上所述,本研究结果表明: 1.大鼠胫骨骨髓腔接种肿瘤细胞后表现出骨质破坏、机械性痛觉超敏,说明骨癌痛模型建立成功。 2.大鼠胫骨癌痛时,双侧脊髓背角TLR4mRNA表达升高,HSP60含量增加,提示癌痛时TLR4信号传导通路被激活,HSP60可能参与其中。 3. Naloxone和LPS-RS抑制TLR4信号通路后能在早期缓解癌痛时大鼠机械性痛觉超敏,其可能机制是抑制了TLR-胶质细胞-炎性细胞因子通路。 4.不同穴位配伍、不同频率、不同强度的电针治疗均对大鼠机械性痛觉超敏无明显缓解作用,说明了电针镇痛在癌痛的治疗中有一定的局限性。但不能由此否认电针针刺对提高药物镇痛效果等方面的作用。
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