西地那非抑制肺动脉平滑肌细胞增殖的分子机制的实验研究  学位论文  

肺高压并非一独立疾病，而是多种疾病所导致的一种病理生理状态，是肺循环生理生化过程异常的综合结果，表现为肺动脉压力进行性升高，肺血管阻力增加，最后可导致右心肥厚、右心功能衰竭的临床综合征。病理上以无肌细动脉肌化，管壁中层增厚，新生内膜形成，管腔狭窄的肺血管重构为特征。因此，如何抑制肺高压中血管重构，特别是抑制肺血管中层平滑肌细胞增殖，已成为肺高压研究的热点。近年来研究发现：磷酸二酯酶V(PDE-5)抑制剂不仅能抑制平滑肌细胞的收缩、扩张肺血管、降低肺动脉压力，而且还具有抑制肺血管重构和平滑肌细胞增殖甚至复构的作用。本研究利用体外实验，探讨西地那非抑制肺动脉平滑肌细胞增殖的可能机制。研究分为3部分： 第一部分：西地那非通过下调丝裂原激活的蛋白激酶44／42(ERK1／2)磷酸化抑制肺动脉平滑肌细胞增殖 目的：通过观察西地那非对ERK1／2磷酸化的影响，探讨西地那非抑制肺动脉平滑肌细胞增殖的机制。 方法：外植块法培养猪肺动脉平滑肌细胞，用培养3～5代的细胞进行实验。细胞分为四组：对照组(C组)；血小板衍生生长因子刺激组(P组)：细胞仅给予20ng／ml浓度的PDGF刺激；西地那非干预组(PS_1和PS_2组)：先分别给予24、96μmol／l西地那非，20min后再给20ng／ml浓度的PDGF刺激。采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)，测定PDGF干预3d后细胞增殖程度，采用5-溴脱氧尿嘧啶(5-Brdu)掺入法，免疫印迹(Western blot)法分别检测PDGF干预24h后细胞DNA合成水平和增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达。Western blot测定干预1h后ERK1／2的磷酸化水平。 结果：P组平滑肌细胞经20ng／ml浓度的PDGF刺激后，其增殖率较对照组明显增加，而PS_1和PS_2组细胞增殖率相对P组明显下降(P＜0.05)。5-Brdu掺入也表明，P组增殖细胞比例达51％，较对照组显著增加(P＜0.01)，而PS_1和PS_2组增殖细胞比例分别下降到32％，27％，较P组明显降低(P＜0.05)。Western blot显示PS_1和PS_2组PCNA的表达较P组明显降低。PDGF刺激后，ERK1／2磷酸化水平10min达高峰，维持1h左右，4小时后显著降低。PS_1和PS_2组1hERK1／2的磷酸化水平较P组明显降低，而总ERK1／2水平4组差别无显著性。 结论：西地那非通过下调ERK1／2的磷酸化，PCNA蛋白表达，从而抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖。 第二部分：西地那非对丝裂原激活蛋白激酶磷酸酶(MKP-1)mRNA和蛋白表达影响的实验研究 目的：观察西地那非对肺动脉平滑肌细胞丝裂原激活蛋白激酶磷酸酶—1(MKP-1)mRNA和蛋白表达的影响，以及cGMP／PKG通路在西地那非诱导MKP-1蛋白表达过程中所起的作用。 方法：外植块法培养猪肺动脉平滑肌细胞，用培养的3～5代细胞进行实验。 1．分别给予0、1.2、24、96、192μmol／l浓度的西地那非干预1h。采用RT-PCR和免疫印迹方法分别测定MKP-1 mRNA和蛋白水平。 2．细胞分为四组：对照组；血小板衍生生长因子刺激组(P组)：细胞给予20ng／ml浓度的PDGF刺激；西地那非组(S组)：仅给96μmol／l西地那非刺激；SP组：先给96μmol／l西地那非，20min后再给20ng／ml PDGF刺激。采用RT-PCR和免疫印迹方法分别测定MKP-1 mRNA和蛋白水平。 3．细胞分为七组：对照组(C组)；DMSO组(D组)：细胞给予0.3％DMSO干预；PKG阻断剂组(R组)：给予25μmol／l Rp-8BrcGMP干预；西地那非组(S组)：给予96μmol／l西地那非干预；RS组：先给25μmol／l Rp-8BrcGMP，30min后再与96μmol／l西地那非孵育；8-BrcGMP组(G组)：仅给100μmol／18-BrcGMP干预；GS组：先给100μmol／18-BrcGMP干预，30min后再与96μmol／l西地那非孵育。七组细胞干预1h后检测MKP-1蛋白表达。 结果：(1)西地那非在0～192μmol／l浓度范围不能增加MKP-1 mRNA的转录，而在0～96μmol／l范围时，浓度正相关地促进MKP-1蛋白表达。(2)P组和SP组MKP-1 mRNA水平较对照组明显升高(P＜0.05)，P组、S组、SP组细胞MKP-1蛋白表达较对照组明显升高(P＜0.05)。(3)Rp-8BrcGMP可显著抑制西地那非引起的MKP-1蛋白上调，而8-BrcGMP促进MKP-1表达，与C组相比差异有显著性(P＜0.05)。GS组MKP-1表达较S组进一步升高(P＜0.05)。 结论： (1)在一定浓度范围内(0～96μmol／l)，西地那非呈浓度依赖性增加MKP-1蛋白表达，与mRNA转录水平无关。 (2)PDGF刺激肺动脉平滑肌细胞后，能负反馈引起MKP-1蛋白合成增加，提前给予西地那非干预能进一步促进MKP-1蛋白表达。 (3)西地那非促进MKP-1蛋白表达与cGMP／PKG通路激活有关。 第三部分：西地那非通过上调丝裂原激活蛋白激酶磷酸酶(MKP-1)抑制肺动脉平滑肌细胞增殖的实验研究 目的：探讨MKP-1蛋白在西地那非抑制肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用。 方法：原代培养肺动脉平滑肌细胞。用培养的3～5代细胞进行实验。细胞分为8组：对照组(C组)；矾酸盐组(V组)：给予Vanadatel2.5μmol／l处理；PKG抑制剂组(R组)：细胞仅给予Rp-8BrcGMP 25μmol／l干预；血小板衍生生长因子组(P组)：细胞只给予20ng／ml PDGF刺激；西地那非干预组(SP组)：先给予96μmol／l西地那非，20min后再给予PDGF刺激；VSP组：先给予12.5μmol／l Vanadate，30min后再给西地那非和PDGF干预；RSP组：先给予25μmol／l Rp-8BrcGMP，30min后再给西地那非和PDGF干预；8-BrcGMP干预组(GP组)：先给予100μmol／18-BrcGMP，20min后再给PDGF刺激。采用MTT染色法，流式细胞检测(FACS)分别测定平滑肌细胞增殖，细胞周期变化，并采用免疫印迹法测定ERK1／2的磷酸化水平。 结果： (1)PDGF(20ng／ml)作用肺动脉平滑肌细胞后促进了ERK1／2的磷酸化，S期细胞比例明显上升，3天后细胞数目增加表现为0D值较对照组显著升高(P＜0.01)。 (2)经西地那非干预后，ERK1／2磷酸化水平、S期细胞比例较P组降低，0D值下降到0.313，较P组差异有显著性(P＜0.05)。 (3)分别给予Vanadate和Rp-8BrcGMP预处理，S期细胞分别上升到19.1％和14.6％，0D值也分别升高到0.41和0.40，较SP组差异有显著性(P＜0.01)。 (4)给予8-BrcGMP能显著抑制PDGF引起的ERK1／2磷酸化上调，S期细胞比例和0D值较P组分别抑制57％和23％，差异有显著性(P＜0.05)。 结论：给予MKP—1阻断剂或者抑制其表达后，能逆转西地那非抑制ERK1／2磷酸化水平，细胞周期进程和降低肺动脉平滑肌细胞增殖。促进MKP-1表达可抑制PDGF引起的ERK1／2磷酸化和细胞增殖。因而，可推断西地那非是通过上调MKP-1的表达、促进磷酸化ERK1／2的降解机制来抑制肺动脉平滑肌细胞增殖。