肺高压并非一独立疾病,而是多种疾病所导致的一种病理生理状态,是肺循环生理生化过程异常的综合结果,表现为肺动脉压力进行性升高,肺血管阻力增加,最后可导致右心肥厚、右心功能衰竭的临床综合征。病理上以无肌细动脉肌化,管壁中层增厚,新生内膜形成,管腔狭窄的肺血管重构为特征。因此,如何抑制肺高压中血管重构,特别是抑制肺血管中层平滑肌细胞增殖,已成为肺高压研究的热点。近年来研究发现:磷酸二酯酶V(PDE-5)抑制剂不仅能抑制平滑肌细胞的收缩、扩张肺血管、降低肺动脉压力,而且还具有抑制肺血管重构和平滑肌细胞增殖甚至复构的作用。本研究利用体外实验,探讨西地那非抑制肺动脉平滑肌细胞增殖的可能机制。研究分为3部分: 第一部分:西地那非通过下调丝裂原激活的蛋白激酶44/42(ERK1/2)磷酸化抑制肺动脉平滑肌细胞增殖 目的:通过观察西地那非对ERK1/2磷酸化的影响,探讨西地那非抑制肺动脉平滑肌细胞增殖的机制。 方法:外植块法培养猪肺动脉平滑肌细胞,用培养3~5代的细胞进行实验。细胞分为四组:对照组(C组);血小板衍生生长因子刺激组(P组):细胞仅给予20ng/ml浓度的PDGF刺激;西地那非干预组(PS_1和PS_2组):先分别给予24、96μmol/l西地那非,20min后再给20ng/ml浓度的PDGF刺激。采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT),测定PDGF干预3d后细胞增殖程度,采用5-溴脱氧尿嘧啶(5-Brdu)掺入法,免疫印迹(Western blot)法分别检测PDGF干预24h后细胞DNA合成水平和增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达。Western blot测定干预1h后ERK1/2的磷酸化水平。 结果:P组平滑肌细胞经20ng/ml浓度的PDGF刺激后,其增殖率较对照组明显增加,而PS_1和PS_2组细胞增殖率相对P组明显下降(P<0.05)。5-Brdu掺入也表明,P组增殖细胞比例达51%,较对照组显著增加(P<0.01),而PS_1和PS_2组增殖细胞比例分别下降到32%,27%,较P组明显降低(P<0.05)。Western blot显示PS_1和PS_2组PCNA的表达较P组明显降低。PDGF刺激后,ERK1/2磷酸化水平10min达高峰,维持1h左右,4小时后显著降低。PS_1和PS_2组1hERK1/2的磷酸化水平较P组明显降低,而总ERK1/2水平4组差别无显著性。 结论:西地那非通过下调ERK1/2的磷酸化,PCNA蛋白表达,从而抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖。 第二部分:西地那非对丝裂原激活蛋白激酶磷酸酶(MKP-1)mRNA和蛋白表达影响的实验研究 目的:观察西地那非对肺动脉平滑肌细胞丝裂原激活蛋白激酶磷酸酶—1(MKP-1)mRNA和蛋白表达的影响,以及cGMP/PKG通路在西地那非诱导MKP-1蛋白表达过程中所起的作用。 方法:外植块法培养猪肺动脉平滑肌细胞,用培养的3~5代细胞进行实验。 1.分别给予0、1.2、24、96、192μmol/l浓度的西地那非干预1h。采用RT-PCR和免疫印迹方法分别测定MKP-1 mRNA和蛋白水平。 2.细胞分为四组:对照组;血小板衍生生长因子刺激组(P组):细胞给予20ng/ml浓度的PDGF刺激;西地那非组(S组):仅给96μmol/l西地那非刺激;SP组:先给96μmol/l西地那非,20min后再给20ng/ml PDGF刺激。采用RT-PCR和免疫印迹方法分别测定MKP-1 mRNA和蛋白水平。 3.细胞分为七组:对照组(C组);DMSO组(D组):细胞给予0.3%DMSO干预;PKG阻断剂组(R组):给予25μmol/l Rp-8BrcGMP干预;西地那非组(S组):给予96μmol/l西地那非干预;RS组:先给25μmol/l Rp-8BrcGMP,30min后再与96μmol/l西地那非孵育;8-BrcGMP组(G组):仅给100μmol/18-BrcGMP干预;GS组:先给100μmol/18-BrcGMP干预,30min后再与96μmol/l西地那非孵育。七组细胞干预1h后检测MKP-1蛋白表达。 结果:(1)西地那非在0~192μmol/l浓度范围不能增加MKP-1 mRNA的转录,而在0~96μmol/l范围时,浓度正相关地促进MKP-1蛋白表达。(2)P组和SP组MKP-1 mRNA水平较对照组明显升高(P<0.05),P组、S组、SP组细胞MKP-1蛋白表达较对照组明显升高(P<0.05)。(3)Rp-8BrcGMP可显著抑制西地那非引起的MKP-1蛋白上调,而8-BrcGMP促进MKP-1表达,与C组相比差异有显著性(P<0.05)。GS组MKP-1表达较S组进一步升高(P<0.05)。 结论: (1)在一定浓度范围内(0~96μmol/l),西地那非呈浓度依赖性增加MKP-1蛋白表达,与mRNA转录水平无关。 (2)PDGF刺激肺动脉平滑肌细胞后,能负反馈引起MKP-1蛋白合成增加,提前给予西地那非干预能进一步促进MKP-1蛋白表达。 (3)西地那非促进MKP-1蛋白表达与cGMP/PKG通路激活有关。 第三部分:西地那非通过上调丝裂原激活蛋白激酶磷酸酶(MKP-1)抑制肺动脉平滑肌细胞增殖的实验研究 目的:探讨MKP-1蛋白在西地那非抑制肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用。 方法:原代培养肺动脉平滑肌细胞。用培养的3~5代细胞进行实验。细胞分为8组:对照组(C组);矾酸盐组(V组):给予Vanadatel2.5μmol/l处理;PKG抑制剂组(R组):细胞仅给予Rp-8BrcGMP 25μmol/l干预;血小板衍生生长因子组(P组):细胞只给予20ng/ml PDGF刺激;西地那非干预组(SP组):先给予96μmol/l西地那非,20min后再给予PDGF刺激;VSP组:先给予12.5μmol/l Vanadate,30min后再给西地那非和PDGF干预;RSP组:先给予25μmol/l Rp-8BrcGMP,30min后再给西地那非和PDGF干预;8-BrcGMP干预组(GP组):先给予100μmol/18-BrcGMP,20min后再给PDGF刺激。采用MTT染色法,流式细胞检测(FACS)分别测定平滑肌细胞增殖,细胞周期变化,并采用免疫印迹法测定ERK1/2的磷酸化水平。 结果: (1)PDGF(20ng/ml)作用肺动脉平滑肌细胞后促进了ERK1/2的磷酸化,S期细胞比例明显上升,3天后细胞数目增加表现为0D值较对照组显著升高(P<0.01)。 (2)经西地那非干预后,ERK1/2磷酸化水平、S期细胞比例较P组降低,0D值下降到0.313,较P组差异有显著性(P<0.05)。 (3)分别给予Vanadate和Rp-8BrcGMP预处理,S期细胞分别上升到19.1%和14.6%,0D值也分别升高到0.41和0.40,较SP组差异有显著性(P<0.01)。 (4)给予8-BrcGMP能显著抑制PDGF引起的ERK1/2磷酸化上调,S期细胞比例和0D值较P组分别抑制57%和23%,差异有显著性(P<0.05)。 结论:给予MKP—1阻断剂或者抑制其表达后,能逆转西地那非抑制ERK1/2磷酸化水平,细胞周期进程和降低肺动脉平滑肌细胞增殖。促进MKP-1表达可抑制PDGF引起的ERK1/2磷酸化和细胞增殖。因而,可推断西地那非是通过上调MKP-1的表达、促进磷酸化ERK1/2的降解机制来抑制肺动脉平滑肌细胞增殖。
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