中风是人类致残、致死的主要原因之一;脑梗塞是脑血管病中最常见的类型.近年来人们对缺血再灌注脑损伤的机制有了全新的认识.Ca<'2+>超载在缺血中心区脑组织的损伤中起重要作用,而细胞凋亡是缺血周边区迟发性神经元损伤的主要原因.最近的研究表明,凋亡也参与缺血中心区的损伤,而Ca<'2+>超载也参与凋亡的发生.抑制凋亡的发生,或者阻止细胞内Ca<'2+>超载,均可以减轻脑组织缺血再灌注损伤.Calbindin D28K(CaBP)是细胞内天然存在的Ca<'2+>缓冲剂,维持细胞内Ca<'2+>稳态,使细胞免受由于Ca<'2+>增高所致的损伤;而XIAP被认为是目前作用最强的凋亡抑制因子,可以同时抑制Caspase-3,7,9,从而抑制凋亡的发生.已有资料表明,二者对缺血再灌注脑损伤有保护作用.血脑屏障和生物膜的存在,不允许大分子多肽或蛋白进入细胞,而通过病毒等载体进行转基因操作则因为存在许多问题,限制了其实际应用.PTD介导的蛋白质转导技术既可以高效地将目的蛋白质转导进入靶器官细胞中,又可以透过血脑屏障进入脑组织神经元,为解决这一问题提出新思路.基于以上情况,该实验选择阻滞Ca<'2+>超载和抑制细胞凋亡这两个作用靶点,首先用原核表达系统表达并纯化融合蛋白PTD-CaBP及PTD-XIAP(BIR3-RING),然后通过PTD介导的蛋白质转导作用,分别在体外和体内研究它们的缺血性脑保护作用,为探索缺血脑保护的新途径提供理论基础.结论1用重组pTrans Vector质粒表达的融合蛋白PTD-XIAP(BIR3-RING)和PTD-Calbindin D28K不仅可以高效地转导进入体外培养的cos7细胞及器官型海马脑片细胞内,而且通过腹腔注射入小鼠体内后可以被吸收入血,穿透血脑屏障而进入脑细胞内;2细胞凋亡在大鼠脑缺血再灌注损伤中起重要作用.缺血2h、再灌注72h后,缺血周边区可见大量的活性Caspase-3(+)及TUNEL(+)细胞;在梗死中心区残存的细胞内也可发现这些阳性细胞.梗死侧半球内出现大量的活性Caspase-3片断,Procaspase-3、9mRNA表达显著上调.3无论体外培养的器官型海马片OGD实验,还是体内大鼠MCAO模型的研究,PTD-XIAP(BIR3-RING)对脑缺血再灌注损伤均具有保护作用,均可以减少海马片细胞的死亡,增加存活细胞;可以抑制缺血周边区凋亡的发生,改善实验动物神经缺损功能的恢复.PTD-Calbindin D28K也得到同样的结果.
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