中国肾移植患者环孢素的遗传药理学研究  学位论文  

第一部分：MDR1、CYP3A4与CYP3A5基因多态性对环孢素药动学的影响 背景与目的： 肾脏移植是终末期肾病的首要选择,在过去的几十年中,肾移植受体和移植物的存活率有了显著提高,这主要归功于高效免疫抑制剂,特别是环孢素A(cyclosporine A,CsA)在肾移植中合理应用。但CsA具有个体间及个体内药代动力学差异大、治疗窗窄的特点,临床上需要对其进行血药浓度监测,从而降低排斥反应及不良反应的发生,提高移植肾的存活率。CsA是P450酶系CYP3A (Cytochrome P4503A, CYP3A)和转运蛋白P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)的底物,CYP3A基因及P-糖蛋白的编码基因多药耐药(Multidrug resistance1,MDR1)基因具有多态性。我们推测其多态性可能是导致CsA药动学个体差异的原因之一。本研究的目的即是考察CYP3A4*1G、CYP3A5*3和MDR1基因多态性对中国肾移植患者术后不同时间CsA药动学的影响。 方法： 选取以CsA+吗替麦考酚酯+糖皮质激素为基础免疫抑制剂治疗的132例中国汉族肾移植患者。采用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性(Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)测定患者MDR1C1236T、G267TT/A, C3435T基因型,聚合酶链反应—连接酶检测反应(Polymerase chain reaction-ligase detection reaction, PCR-LDR)测定患者CYP3A4*1G及CYP3A5*3基因型。CsA全血谷浓度(服药前浓度,C0)及峰浓度(服药后2小时浓度,C2)采用荧光偏振免疫分析法测定,并以CsA浓度/(日剂量/体重)为校正浓度,采用单因素分析法(ANOVA或Kruskal-Wallis H检验)和多元线性回归法,考察基因多态性及性别、随访年龄、红细胞比容(hematocrit,HCT)、血清肌酐(serum creatinine, Scr)、血清谷丙转氨酶(alanine transaminase,ALT)、血清白蛋白(serum albumin, ALB)等临床混杂因素对肾移植患者术后不同时间(术后0-7天、8-15天、16-30天、2-12个月及1年以上)CsA校正浓度的影响。 结果： 1.基因型分布情况 132例肾移植患者中,MDR11236T、MDR12677T、MDR12677A、MDR13435T.CYP3A4*1G和CYP3A5*3的频率分别为64.8%、39.4%、15.5%、37.5%、22.3%及74.2%。连锁分析显示CYP3A4*1G与CYP3A5*3存在较高程度的连锁,D’值为0.83,其他位点之间连锁程度较低。CYP3A4*1G与CYP3A5*3单倍体构建的结果显示：GG型为71.5%,AA型为19.5%,而AG和GA型分别为2.8%和6.2%。 2.单位点分析 单因素分析显示MDR1C1236T与移植术后8-15天CsA的谷浓度及术后1年以上的峰浓度及谷浓度相关。MDR1G2677T/A与移植术后1年以上峰浓度及谷浓度相关。MDR1C3435T则与术后16-30天的峰浓度及术后1年以上峰谷浓度相关。CYP3A4*1G影响移植术后1个月以后峰浓度及谷浓度。CYP3A5*3与术后1个月以后的峰谷浓度相关。 应用多重线性回归的方法,考察引入多个临床协变量后,基因多态性对CsA浓度的影响。结果与单因素分析有较大差别,MDR1C1236T与移植术后1-15天CsA的谷浓度及术后1年以上的峰浓度相关。MDR1G2677T/A与移植术后1年以上峰浓度及术后16天至1年的谷浓度相关。MDR1C3435T则与术后16-30天和1年以后的谷浓度以及8-30天的峰浓度相关。CYP3A4*1G影响移植术后1年以后的谷浓度以及8天以后的峰浓度。CYP3A5*3只与术后1年以后的谷浓度相关。结果总结见表2。 表1基因多态性对CsA血药浓度的影响(多重回归分析结果总结) 3. CYP3A4/5联合分析 CYP3A4*1G-CYP3A5*3联合基因型影响患者术后1年以后校正谷浓度与峰浓度,亦影响术后1年以内的峰浓度,结果总结见表2。CYP3A4/5AA-AA型患者校正浓度低于GG-GG型患者：术后1年以后,GG-GG型的谷浓度平均为28.67mg/ml,而AA-AA型为8.19mg/ml,较GG-GG型低约70%;GG-GG型的峰浓度平均为202.10mg/ml,而AA-AA型为127.65mg/ml,较GG-GG型低约37%。但多重线性回归分析显示各模型校正R平方均<20%,因此可解释总变异的比例较低。 表2CYP3A4/5联合基因型对CsA血药浓度的影响 4. MDR1与CYP3A联合分析 采用多重线性回归,分析CYP3A4/5联合基因型与MDR1联合基因型对CsA血药浓度的共同影响。CYP3A4/5联合基因型与MDR1联合基因型进入同一回归模型中。结果显示CYP3A4/5影响术后1个月以后的峰浓度及谷浓度,与1个月以内的谷浓度亦呈相关性。而MDR1只影响移植术后1年以后的谷浓度,结果总结见表3。多重线性回归模型显示,在术后1年以后,MDR1与CYP3A4/5基因总变异可解释CsA谷浓度个体间总变异的36.3%,峰浓度的12.9%。 表3MDR1及CYP3A4/5联合基因型对CsA血药浓度的共同影响 5.非遗传学因素对CsA代谢的影响 年龄、HCT.ALT.Scr分别在不同的时间影响CsA的谷浓度与峰浓度。ALB与性别因素对CsA的浓度影响相对较小。 结论： CYP3A4*1G与CYP3A5*3影响CsA的谷浓度及术后1个月以后的峰浓度,MDR1只对移植术后稳定期(1年以后)的谷浓度有影响,对峰浓度没有影响。MDR1与CYP3A4/5单独都难以解释CsA浓度个体差异,但MDR1与CYP3A4/5共同遗传变异可解释肾移植术后1年以后CsA谷浓度个体差异的36.3%,峰浓度的12.9%。肾移植术后CsA浓度个体差异的原因不仅与遗传变异有关,还受到年龄、红细胞比容和肝肾功能等非遗传因素的影响。本研究结果在一定程度上可解释肾移植术后CsA浓度个体间差异的原因。 第二部分：MDR1、CYP3A4、CYP3A5及FOXP3基因多态性对环孢素药效学的影响 背景与目的： CsA不仅药动学个体差异大,药效学亦表现出较大的个体差异,即相同的血药浓度可能会导致不同的药物效应。目前,临床上主要对CsA血药浓度进行治疗药物监测,并探索药物转运蛋白及相关代谢酶遗传多态性对其药动学的影响,较少对其药效学及影响因素的评价和监测。本研究在考察CYP3A4*1G、 CYP3A5*3和MDR1C1236T、G2677T/A、C3435T多态性对CsA药动学的影响的基础上,进一步探索其对CsA药效学的影响。 CsA通过抑制IL-2的产生,不仅抑制辅助性T细胞的活化,而且抑制了调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)。FOXP3是Treg的管家基因,其表达与Treg的功能及肾移植患者排斥反应相关。FOXP3基因具有多态性,其中启动子区域的rs3761547(-3499A/G)、rs3761548(-3279A/C)与rs2232365(-924A/G)在中国人中有较高的突变频率。多项研究证明FOXP3基因突变与一些自身免疫性疾病的发病相关。但FOXP3基因多态性对肾移植患者CsA免疫抑制效应的影响,目前国内外尚未见文献报道。 因此,本部分研究的目的即是：探索CYP3A4*1G、CYP3A5*3、MDR1(C1236T.G2677T/A和C3435T)以及FOXP3(rs3761547、rs37615483和rs2232365)基因多态性对中国肾移植患者CsA免疫抑制效应(预防排斥反应)的影响。 方法： 131例接受CsA+吗替麦考酚酯+糖皮质激素作为基础免疫抑制治疗的中国汉族肾移植患者,根据排斥反应发生与否,分为排斥组(58例)和未排斥组(73例)。所有排斥反应,均经过肾穿刺后病理证实,根据Banff05分级,分为抗体介导的急性排斥反应,T细胞介导的急性排斥反应、抗体介导的慢性排斥反应、T细胞介导的慢性排斥反应。FOXP3rs3761547、rs3761548与rs2232365基因型采用Taqman探针法测定。采用Binary logistic回归比较不同基因型患者移植术后1年、2年、3年及5年的移植排斥发生率。应用Kaplan-Meier分析及log-rank检验进行事件史分析(生存分析),移植术后第一次排斥反应被定义为事件,发生时间定义为生存时间。Cox回归分析考察基因变异及临床非基因组因素(包括CsA浓度、年龄、性别、身高、诱导治疗及器官来源)对患者总排斥率的影响。进一步采用Kaplan-Meier分析考察基因变异对急性T细胞介导排斥反应发生的影响(移植术后第一次急性T细胞介导排斥反应,定义为事件)。 结果： 1.基本资料及CsA血药浓度 排斥组和未排斥组患者年龄、性别、体重、身高、冷缺血时间、是否应用诱导治疗、器官来源(尸体供肾或活体供肾)及术后1个月、1年、2年、3年和5年的CsA血药浓度,均无明显差异。 2.基因型分布 在131例中国汉族肾移植患者中,FOXP3基因rs3761547G、rs3761548C和rs2232365G的发生频率分别为13.4%、83.6%和24.8%。连锁分析显示rs3761547与rs3761548, rs3761547与rs2232365, rs3761548与rs2232365之间,D’分别为0.99,0.96和0.57。rs3761547-rs3761548-rs2232365单倍体频率：ACA型为70.2%,GCG型为13.0%,AAG型为11.8%,AAA和GCA分别为4.6%和0.4%。 3. Binary logistic回归分析 在肾移植术后1年、2年、3年及5年内,分别有41例、52例、54例和55例患者发生了排斥反应,另外有3例患者在移植术后5年以后发生了排斥反应。CYP3A4*1G、CYP3A5*3、MDR1基因C1236T、G2677T/A、C3435T及FOXP3基因rs3761547、rs2232365不同基因型患者排斥发生率,无显著性差异(P>0.05)。而rs3761548的多态性则对肾移植排斥发生率有显著影响。在术后1年内,携带有rs3761548AA型患者,发生排斥的概率是CC患者的3.79倍(95%CI：1.11-12.95,P=0.034),术后2年内,AA型是CC型的5.82倍(95%CI：1.48-15.93,P=0.012),术后3年内,AA型是CC型的5.33倍(95%CI：1.36-14.97,P=0.017),术后5年内,AA型是CC型的5.11倍(95%CI：1.30-14.07,P=0.019)。 4. Kaplan-Meier及Cox回归分析 Kaplan-Meier分析显示rs3761548对肾移植排斥反应的发生有显著影响,AA型患者肾移植术后发生首次排斥反应的时间要早于CC型患者(Logrank=6.952, P=0.031), AA型与CC型患者发生排斥反应的时间分别是术后35.71±14.50月和73.18±6.00月。应用Cox比例风险模型显示,在引入其他各混杂因素后,rs3761548多态性依然显著影响肾移植排斥反应的发生(HR2.70,95%CI1.22-5.96,P=0.014)。联合基因型分析显示3761547-3761548AA-AA型患者发生排斥反应的风险比是AG-CC型患者的2.83倍(95%CI1.22-6.58,P=0.016)。而CYP3A4、 CYP3A5、MDR1及FOXP3rs3761547、rs2232365多态性对肾移植排斥反应的发生没有显著影响。非基因组因素对排斥发影响无统计学意义。 以急性T细胞介导排斥反应作为终点事件,进行Kaplan-Meier分析,结果显示只有rs3761548多态性与急性T细胞介导的排斥发生密切相关(Log Rank=7.853,P=0.020),而CYP3A4*1G、CYP3A5*3、MDR1及FOXP3rs3761547与rs2232365,均对急性T细胞介导的排斥发生无显著影响。结论： CYP3A4*1G、CYP3A5*3、MDR1(C1236T、G2677T/A、C3435T)及FOXP3(rs3761547及rs2232365)多态性对CsA抑制排斥反应无明显影响,而FOXP3rs3761548位点的基因多态性与CsA抑制排斥反应的疗效密切相关。在给予CsA进行基础治疗的中国汉族肾移植患者中,rs3761548AA型患者比CC患者更容易发生排斥反应,AA型患者可能需要更强效的免疫抑制方案来预防排斥反应的发生。