Brevican在脑胶质瘤发生中的生物学作用及其机制研究  学位论文  

第一部分Brevican在脑胶质瘤中表达及其临床意义 脑胶质瘤是临床上最常见的中枢神经系统恶性肿瘤,发病率占全部颅内肿瘤的50%左右。在脑胶质瘤的不同组织分型中,以星形胶质细胞起源的肿瘤最为多见。根据WHO2000年肿瘤病理分级标准,所有星形胶质细胞瘤分为四级(Ⅰ级～Ⅳ级)。胶质瘤患者预后往往不良,特别是其胶质母细胞瘤(Ⅳ级)患者的生存期往往不到一年。为进一步改善脑胶质瘤的治疗效果,研究者一直致力于发现新的具有诊断和/或治疗意义的生物标志分子,但是直至目前为止,尚未发现一种理想的、能够很好地满足临床需要的生物标志物(Biomarker)。 短蛋白聚糖(Brevican)又称为脑富含的透明质酸结合蛋白,是近年来新发现的一种中枢神经系统特有的硫酸软骨素蛋白聚糖(Chondroitin Sulfate Proteoglycan, CSPG)。Brevican是lectican家族的新成员,由于其长度最短故称为短蛋白聚糖。目前已有较多的文献报道,Brevican的表达与脑胶质瘤的发生有关,而且与胶质瘤的侵袭性密切相关。然而,Brevican在各级星形胶质细胞瘤中的表达特点目前还不清楚；Brevican是否能够成为新的、有价值的星形胶质细胞瘤生物标志分子尚有待进一步研究证实。 在本部分的研究中,我们通过分子克隆技术,获得含Brevican片段的融合蛋白,用该融合蛋白免疫新西兰兔,获得抗血清,进而纯化出抗Brevican抗体。我们用此抗体系统地检测了Brevican分子在脑胶质瘤及良性对照组(脑膜瘤和无激素垂体瘤)中的表达特征,揭示了Brevican表达与脑胶质瘤之间的关系,特别是与病理分级、分化和浸润程度的关系。我们发现,Brevican的表达主要定位于胶质瘤细胞的细胞浆以及细胞外基质中,弥漫表达,染色淡黄至棕黄,有的均质状,有的细颗粒状。Brevican的表达与患者年龄、性别无关(均为P>0.05)；在良性对照组中表达量很低,阳性率仅为22.5%(9/40)；而在胶质瘤中表达水平则较高,阳性率可达68.3%(41/60),并且随着胶质瘤恶性程度(从Ⅰ级的毛细胞型胶质瘤至Ⅳ级的胶母型胶质瘤)的提高,其阳性率逐级增高,且免疫组化的阳性积分也逐级升高。因而,Brevican可能是胶质瘤患者预后的一个有价值的生物标志,对病情的评估、预后的判断有较高的价值。 第二部分Brevican在胶质瘤细胞中的生物学功能研究 目前,脑胶质瘤的发生、发展的具体机制均不清楚。胶质瘤呈侵袭性生长,这一重要特性为其本质特征,明显有别于其他恶性肿瘤,也是胶质瘤复发率高、预后不良的重要原因。瘤体本身也就是浸润性生长物,它和正常脑组织没有明显的界限,给手术治疗带来困难,对放、化疗亦不甚敏感。我们的研究已表明,Brevican的表达水平与脑胶质瘤的进展呈正相关关系,但Brevican在生长、侵袭、进展中具体作用及机制尚未明确。因此,本部分我们以调控Brevican基因表达为起始点,通过上调(overexpression)或者下调(knockdown) Brevican的表达水平,比较分析其对胶质瘤细胞生物学效应的影响以及其在相关信号传导通路中的作用及机制。 本研究我们建立了Brevican稳定过表达的U251-Brevican (TU251细胞”)和293T-Brevican细胞株,实验发现,在不同的粘附介质上,这两株细胞的粘附能力较相应的对照细胞明显增强,特别是在纤维连接蛋白(FN)存在时；而且,U251-Brevican细胞的迁移能力也明显增强。另外,我们利用RNA干扰技术,通过构建并转染pSuper-Brevican shDNA,表达相应的shRNA,从而下调Brevican在TU251细胞中的表达水平。在此基础上,我们发现这类Brevican knockdown的细胞,CCK-8和克隆形成实验均表明其增殖能力下降；细胞免疫荧光显示细胞之间的扩散、伸展能力下降,进一步通过划痕实验(Wound-healing assay)也证实其迁移能力明显较对照组降低；穿透Marigel的能力也变弱。更进一步,对Brevican在人工构建的胶质瘤TU251细胞中的信号调节机制研究发现,在Brevican表达抑制的TU251细胞被EGF激活后,Brevican表达下调导致细胞活化后丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK),包括Erkl/2的磷酸化过程被部分抑制,即Brevican的表达下调降低了MAPK在TU251细胞活化过程中的活性。这提示Brevican在TU251细胞的活化过程中参与了对MAPK信号通路的调节。同时,我们的实验也揭示Brevican knockdown细胞中Akt的磷酸化水平也明显低于对照的TU251-shDNA mock细胞,这说明Brevican也参与了Akt信号通路的调节,从而调节细胞的增殖、迁移和浸润。 我们的研究显示,Brevican在胶质瘤细胞增殖、生长以及调节细胞的生物学行为包括维持细胞形态、粘附、迁移以及侵袭中发挥了极其重要的作用；本研究也首次揭示了Brevican在胶质瘤细胞的活化过程中参与了对MAPK以及P13K/Akt信号通路的调节。近年来,神经系统的细胞外基质(NECM)日益引起重视,脑胶质瘤的NECM的可溶性(液化程度)增加,这都可能与Brevican的上调程度有关。因而,特异性地阻断胶质瘤中Brevican的表达或酶裂解其蛋白,有可能为胶质瘤的治疗和预防复发提供新的途径。 第三部分Brevican在肿瘤形成中的作用及其机制研究 胶质瘤是起源于神经外胚层的恶性肿瘤,一般不发生颅外转移,较晚期才出现明显的临床症状,导致获得诊断时肿瘤多已为晚期,故手术难以完全切除。 本部分研究主要是应用我们建立的Brevican抑制表达细胞(TU251-pSuper-shDNA2细胞)和对照组(TU251-pSuper-shDNA mock、TU251未处理)细胞,裸鼠皮下接种,观察、比较这两组细胞在肿瘤形成中的差别,从而明确Brevican在转化的胶质瘤细胞在肿瘤形成中的作用。同时,更重要的是,我们也进行了转化胶质瘤细胞的裸鼠颅内接种,这样可以在更接近于脑胶质瘤形成的微环境条件下,比较脑胶质瘤成瘤过程；因而,更可靠地研究胶质瘤颅内生长情况和检验该肿瘤标志Brevican确切的临床价值。通过本部分实验,我们更深入地揭示Brevican基因在脑胶质瘤形成和发展的作用；实验显示,在将Brevican表达抑制的TU251细胞即TU251-pSuper-shDNA2细胞以及对照组(TU251-pSuper-shDNA mock细胞、TU251未处理细胞)皮下注射后4w(28d)时,Brevican表达抑制的TU251-pSuper-shDNA2细胞成瘤能力明显低于对照组细胞(P<0.05)；同样,在以上两组细胞进行颅内接种25d后,也观察到TU251-pSuper-shDNA2细胞的致瘤能力降低(P<0.01)。 上述转化胶质瘤细胞的动物体内成瘤实验亦进一步证实,Brevican在脑胶质瘤形成中发挥了极其重要作用。Brevican水平降低与胶质瘤的形成、扩展能力下降密切相关,进一步说明Brevican基因和／或编码的产物可成为治疗胶质瘤的新靶点,而且使其更具针对性；利用RNAi技术使Brevican表达下调,即可以降低Brevican蛋白的含量及活性,从而阻断肿瘤细胞从原发区向周围正常组织的迁移、扩散,也可巩固手术和放疗等局部治疗的疗效。因而,该研究为胶质瘤的治疗提供了一种新的思路；这样,可对肿瘤细胞更具特异性,而对正常脑组织损伤更小。 综上所述,Brevican有望成为有效的脑胶质瘤诊断标志物和基因治疗靶点。