组织因子途径抑制物-2(tissue factor pathway inhibitor-2,TFPI-2)又称胎盘蛋白—5(placenta protein-5,PP-5)和基质相关丝氨酸蛋白酶抑制剂(matrix associated serine protease inhibitor,MSPI),是一种带有kunitz型结构域的蛋白酶抑制剂,属于丝氨酸蛋白酶抑制物超家族成员。成熟的人TFPI-2由富含酸性氨基酸的N端、三个串联的kuntiz结构域和富含碱性氨基酸的C端组成。已有多篇文献报道人TFPI-2能够抑制胰蛋白酶、纤溶酶、糜蛋白酶、血浆缓激肽释放酶、组织蛋白酶G和多种基质金属蛋白酶(MMPs)的活性,从而对抗多种恶性肿瘤的侵袭转移,如前列腺癌、肺癌、纤维肉瘤、黑色素瘤和神经胶质瘤等。此外,人TFPI-2还可以抑制动脉粥样硬化斑块的脱落。但迄今为止,TFPI-2的生理功能尚不清楚,TFPI-2与其它蛋白质相互作用的信息也知之有限。 我们利用酵母双杂交技术筛选出与TFPI-2相互作用的候选蛋白,其中一个是鞘脂激活蛋白原prosaposin(PSAP)。PSAP是一个具有多种神经营养作用的多功能糖蛋白,最初被认为是4种鞘脂激活蛋白saposinA、B、C和D的前体。鞘脂激活蛋白saposinA、B、C和D功能是作为鞘脂糖水解途径中所涉及到的溶酶体酶激活剂。成熟的saposins由prosaposin通过蛋白水解途径产生,再运送至溶酶体。而PSAP作为完整的分泌性蛋白出现,存在于多种生物体液中,如人的乳汁、血清、脑脊液和精液浆中,另外也存在于神经及其它质膜中。 本研究工作主要集中于TFPI-2与PSAP相互作用的进一步确认,主要内容及结果如下： 1)通过酵母共转化、细胞共定位、GST-pulldown和免疫共沉淀等技术,逐步确定了TFPI-2和PSAP在酵母、真核细胞及细胞外的相互作用。 2)建立了HEK293T细胞的PSAP真核表达体系,表达纯化了具有高纯度及活性的重组人PSAP-His蛋白。 3)运用酵母共转化技术,鉴定出两者相互作用的部位分别位于PSAP的C末端和TFPI-2的第二个结构域(TFPI-2/KD2)。 4)通过细胞侵袭及迁移实验,发现PSAP可以促进人纤维肉瘤细胞的侵袭及迁移能力,而TFPI-2可以抑制PSAP的这一作用。此外,通过明胶酶谱实验我们发现PSAP可以增强HT1080细胞分泌的MMP-2的活性并呈剂量依赖性,而TFPI-2同样也可以抑制PSAP的这一作用。 5)另外,我们发现TFPI-2抑制以蛋白酶活性这一功能并不受蛋白PSAP的影响。 6)通过Western BlOt及RT-pcr实验,证实了TFPI-2在HT1080细胞中表达沉默,而PSAP的mRNA和蛋白均可被检测到。TFPI-2的表达不影响PSAP在HT1080细胞中的mRNA或者蛋白表达水平。 结论：TFPI-2通过第二个结构域与PSAP的C末端结合,并对其促进纤维肉瘤侵袭迁移功能具有显著的抑制作用；PSAP对TFPI-2的功能没有影响。
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