[1]复旦大学附属眼耳鼻喉科医院,上海200031
[2]复旦大学分子医学教育部重点实验室
目的:构建脑源性神经营养因子(BDNF)绿色荧光蛋白(GFP)融合表达质粒,观察其融合蛋白的特性。方法:将BDNFcDNA片段插入pcDNA3.1/NT-GFP-TOPO真核表达质粒,使其与GFP同处一个阅读框架中,测序鉴定后,转染培养的雪旺细胞,用免疫组织化学和蛋白质印迹(Western botting)观察外源性目的:蛋白的表达情况,并用该质粒活体转染视神经切断的大鼠模型,观察所表达外源性蛋白的神经保护作用。结果:测序证实质粒构建成功。Westernbotting结果显示,BDNF-GFP融合蛋白表达一相对分子质量为41×10^3。大小条带。荧光显微镜下可见BDNF－GFP转染的细胞发出绿色荧光,免疫组织化学染色后,可见绿色荧光与红色荧光完全重合。转染BDNF-GFP质粒和GFP质粒的大鼠视神经切断术后7d存活视网膜神经节细胞(RGC)分别为(1201±286)、(482±151)个/mm^2,存活百分比分别为(51.39±12.24)%和(20.62±6.46)%;28d时存活的RGC分别为(715±71)、(112±24)个/mm^2,存活百分比分别为(30.59±3.04)%和(4.79±1.03)%。两组存活百分比比较,差异有统计学意义(t=3.144,11.378;P<0.01)。结论:BDNF-GFP融合表达载体可以转录翻译为一融合蛋白,该蛋白可自发绿色荧光,并具有BDNF的生物学活性。
(8.0+极速模式)