小G蛋白Rac1介导硫化氢促血管新生作用的信号转导机制研究  学位论文  

硫化氢(H2S)是一种无色有臭鸡蛋味的气体,大量吸入会导致中毒。近年来,越来越多的研究表明,H2S成为继一氧化氮(NO)、一氧化碳(CO)之后的第三个气体信号分子。内源性H2S在机体的各个系统中都发挥着重要的作用。在神经系统中,H2S可以增强NMDA受体的活性,易化长时程动作电位的产生,进而对记忆过程产生影响；H2S可以通过清除氧自由基进而发挥其保护神经细胞的作用。在心血管系统中,H2S能开放ATP敏感的钾离子(KATP)通道,使血管平滑肌舒张,降低血压；体内H2S生成减少与自发性高血压的形成有密切关系,外源性给予H2S有显著降压效果,缓解高血压的进程；另外,H2S可以通过胞内信号转导通路发挥其心脏保护效应来对抗心脏的缺血/再灌注损伤。在炎症免疫系统中,既有H2S抗炎效应的报道,也有H2S促炎效应的报道。另外,在机体代谢方面,H2S可以显著地降低机体的代谢率；H2S可以调节体内胰岛素的释放。H2S甚至在延长机体寿命方面也发挥着其相应的作用。 在血管新生方面,我课题组于2007年在国际上首次发现H2S具有显著的促血管新生效应,该研究成果不仅在体外管腔形成实验,而且在小鼠Matrigel Plug动物模型上都得到了证实。随后Szabo C等在鸡胚绒毛膜尿囊(CAM)模型中也证实了H2S的促血管新生效应。我课题组于2009年,在大鼠一侧下肢缺血模型中再次证实,外源性H2S可以显著地促进大鼠缺血下肢的血管新生,该研究提示H2S在缺血下肢中的促血管新生效应可能通过上调骨骼肌细胞中VEGF的表达,进而作用于血管内皮细胞中VEGFR2受体而实现。Andreas Papapetropoulosa等的研究证实,内源性产生的H2S是血管新生的促进因子；他们利用鸡胚绒毛膜尿囊(CAM)模型,给予内源性H2S生成酶的抑制剂显著地抑制了血管新生过程；另外,在主动脉环血管新生模型中,CSE基因敲除小鼠的主动脉环对VEGF的血管新生反应显著地低于野生型小鼠。他们的研究结果认为,H2S的促血管新生效应依赖于KATP channel-MAPK信号通路。然而,H2S促血管新生作用的具体分子机制并不清楚。 血管新生与血管内皮细胞的增殖及迁移过程密切相关,其中,血管内皮细胞的迁移过程在血管新生过程中发挥了重要的作用。本研究以原代培养的人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs)为研究对象,主要针对H2S的促内皮细胞的迁移效应及其具体分子机制进行研究,以期阐明H2S促血管新生的具体分子机制。 首先,我们研究了H2S对HUVECs体外血管新生的作用。用细胞划痕损伤模型和transwell跨膜迁移模型研究H2S对HUVECs迁移的影响,结果证实50μ M的NaHS处理能显著地促进内皮细胞的迁移能力；内皮细胞体外管腔形成实验结果表明,50μM的NaHS显著促进HUVECs体外管腔的形成；用BrdU掺入法检测H2S对HUVECs增殖的影响,结果显示,50μM的NaHS显著抑制HUVECs的细胞增殖。该结果提示,H2S的促HUVECs体外血管新生效应主要依赖于其促内皮细胞迁移效应。 其次,研究H2S对HUVECs肌动蛋白细胞骨架及细胞黏着斑的影响。细胞免疫荧光结果表明,H2S使HUVECs肌动蛋白细胞骨架重构,以细胞前端片状伪足生成增多为典型特征；H2S对HUVECs细胞paxillin-contained黏着斑的分布没有显著影响。Western Blot结果显示,H2S对胞内paxillin Tyrl18和Serl26位的磷酸化没有影响；但是H2S可以时间依赖性地促进FAK (Tyr576/577)位的磷酸化。这些结果表明,H2S使HUVECs肌动蛋白细胞骨架重构,这很可能是H2S促内皮细胞迁移效应的关键；另外,FAK的磷酸化也可能在H2S促内皮细胞迁移效应中发挥作用。 然后,研究H2S对小G蛋白Rho家族成员活性的影响。Pull-Down结果显示,H2S可以一过性地活化小G蛋白Rac1,但对RhoA和Cdc42的活性没有显著影响；G-LISA结果再次证实了H2S对Rac1的一过性活化作用；NaHS与人源性重组蛋白Rac1的细胞外直接反应结果表明,H2S并不能直接活化Rac1,该结果提示,Racl的活化是由胞内上游信号分子的活化所介导的。 接着,研究Rac1是否介导了H2S所致的促内皮细胞迁移效应及促血管新生效应。首先,成功地建立了内皮细胞的电转染体系；针对Rac1基因,分别为内皮细胞转染dominate negative Rac1质粒及对Rac1基因进行RNA干扰,细胞免疫荧光结果显示,Rac1介导了H2S所致的HUVECs肌动蛋白细胞骨架重构；细胞划痕损伤模型和transwell跨膜迁移模型结果显示,Rac1介导了H2S所致的促HUVECs迁移效应；体外管腔形成实验结果显示,Rac1介导了H2S所致的促HUVECs体外血管新生效应。 再次,我们对H2S所致Rac1活化的上下游信号通路进行了研究。应用VEGFR的阻断剂SU5416和P13K的阻断剂LY294002预处理,可以显著地抑制H2S所致Rac1活化；细胞免疫荧光结果显示,SU5416和LY294002预处理,可以抑制H2S所致的HUVECs细胞片状伪足的伸出；同时细胞迁移实验结果显示,SU5416和LY294002预处理也显著地抑制了H2S所致的促HUVECs细胞迁移效应。这些结果表明,VEGFR-PI3K信号通路介导了H2S所致的Rac1活化；VEGFR-PI3K信号通路介导了H2S所致的HUVECs细胞肌动蛋白细胞骨架重构；VEGFR-PI3K信号通路介导了H2S所致的促HUVECs细胞迁移效应。转染dominant negativeAkt后,H2S所致的Rac1活化并不能被抑制,说明H2S所致的Rac1活化并不依赖于Akt的活化。另外,激酶抑制剂研究结果表明,ERK独立于VEGFR-PI3K信号通路,也在H2S所致的促HUVECs迁移效应中发挥着一定的作用。转染dominant negative Rac1质粒及Rac1SiRNA后, H2S所致的cofilin Ser3位的磷酸化被显著抑制,说明cofilin是Rac1的下游效应分子；cofilin作为肌动蛋白结合蛋白很可能直接调控了H2S所致的内皮细胞肌动蛋白细胞骨架的重构。 最后,检测CSE和CBS在HUVECs内皮细胞的表达及在大鼠胸主动脉内膜内皮细胞层的表达与分布。RT-PCR结果显示,在基因水平上,HUVECs内皮细胞既表达CSE又表达CBS; Real-Time PCR结果表明,mRNA水平上CBS的表达远高于CSE,大约是CSE基因水平的64倍之多；Western Blot结果显示,在蛋白质水平上,]HUVECs内皮细胞既表达CSE同时也表达CBS；免疫组织化学结果显示,大鼠胸主动脉内膜内皮细胞层不仅有CSE的表达,而且也有CBS的高表达。这些结果说明,在动脉内膜内皮细胞层,不仅有CSE的表达,而且同时有CBS的表达。这为研究内源性H2S在心血管系统中的作用打下了一定基础。 总之,我们的研究首次证实了：①小G蛋白Rac1介导了H2S的体外促血管新生效应,该效应的发挥主要是通过肌动蛋白细胞骨架重构所致的内皮细胞迁移能力增强所实现的；②VEGFR-PI3K信号通路介导了H2S所致的Rac1的活化；③Cofilin是Racl的下游效应分子,它可能直接介导了H2S所致的内皮细胞肌动蛋白细胞骨架的重构,进而在内皮细胞运动过程中发挥作用；④血管内皮系统既有CSE的表达,又有CBS的表达。