第一部分人喉鳞状细胞癌中BMI1基因的检测 目的探讨人喉鳞状细胞癌标本中BMI1基因的表达情况及BMI1基因的表达与喉癌的临床分期与分型之间的关系。 方法收集人喉鳞状细胞癌肿瘤标本和癌旁组织,免疫荧光染色法定性检测BMI1基因在喉癌标本中的表达情况,Real-time PCR和Western Blot从分子水平和蛋白水平定量比较BMI1基因在喉癌标本与正常癌旁组织中的表达情况,以及BMI1的表达情况与临床分期与分型之间的关系。 结果取得20例喉鳞状细胞癌标本和20例正常癌旁组织标本。其中1-2期喉癌标本6例,3-4期标本14例；声门型标本4例,声门上型标本16例。肿瘤组织进行BMI1基因免疫荧光染色观察可见BMI1基因普遍表达。Real-time PCR结果显示BMI1在肿瘤标本中的表达明显高于癌旁组织(p<0.01),其中3-4期肿瘤中的表达约为1-2期肿瘤中的2倍(p<0.01),但是声门型与声门上型中BMI1表达的比较不具有显著差异。Western Blot的结果也与Real-time PCR的结果一致。 结论BMI1在喉鳞状细胞癌中显著表达,其表达程度与肿瘤的临床分期有关,但是与肿瘤的分型无明显关系。 第二部分BMI1基因对于人喉癌Hep-2细胞系的作用 目的将Hep-2细胞与RNA干扰细胞进行比较,研究BMI1基因对于人喉癌Hep-2细胞系的作用。 方法构建慢病毒载体,shRNA干扰使喉癌Hep-2细胞系的BMI1基因表达下调。正常培养Hep-2细胞和RNAi细胞于96孔板上,在1、3、5、7天观察生长状态并用CCK-8法测定细胞的增殖状态。用有限稀释法将培养在96孔板中的两种细胞制成单个细胞悬液并培养2周,观察克隆形成能力并与固定测量框比较计算面积比。将Hep-2细胞与RNAi细胞培养后用TUNEL和FITC-Annexin V染色,比较细胞凋亡能力。PI染色后用流式细胞仪比较两种细胞的周期分布情况。两种细胞培养后接受剂量为2Gy、4Gy和8Gy的X射线放疗,48小时后以CCK-8法测吸光度值并计算抑制率,比较对放疗的耐受性。两种细胞中加入3μg/mL,6μg/mL和12μ g/mL的顺铂注射液,培养24小时后以CCK-8法比较对化疗的耐受性。将1×105的Hep-2和RNAi细胞分别注入10只NOD/SCID小鼠的腋窝皮下,8周后观察成瘤情况,比较两组细胞的致瘤能力。 结果shRNA干扰使BMI1表达下调,干扰效率为83.75%。Hep-2细胞和RNAi细胞培养1周后测吸光度值,可见从第三天起RNAi细胞的吸光度明显低于Hep-2细胞,并且有停止生长趋势。单个Hep-2和RNAi细胞在96孔板中培养2周后观察并用固定测量框比较面积比,可见RNAi细胞形成细胞球体积显著减小,面积比也降低(p<0.01)。两组细胞用TUNEL染色后观察可见RNAi细胞呈现较强的凋亡能力,FITC-Annexin V染色后用流式细胞仪分析结果也表明RNAi细胞更容易发生凋亡(p<0.01)。PI染色后用流式细胞仪检测两组细胞的周期分布,结果显示RNAi细胞处于G0/G1期的细胞比例显著增高,S期和G2/M期的比例都显著降低。经2Gy、4Gy和8Gy的放疗后RNAi细胞对放疗的抑制性显著增加。经3μg/mL,6μg/mL和12μ g/mL的顺铂化疗后结果显示随着剂量的增加,RNAi细胞的抑制率在各个剂量都比Hep-2高。体内成瘤实验结果显示RNAi组形成的肿瘤体积明显减小,重量减轻(p<0.01)。 结论BMI1沉默能够抑制Hep-2细胞的增殖能力,促进期凋亡,促使细胞在G0/G1期聚集,减少对放化疗的耐受性,并且能够抑制体内成瘤能力。 第三部分人喉癌Hep-2细胞系肿瘤干细胞中BMI1基因的检测 目的探讨BMIl与CD133在喉癌标本中的共同表达情况以及BMI1在CD133+喉癌干细胞中的表达情况。 方法BMI1与CD133在喉癌标本中进行免疫荧光染色,荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察。流式细胞仪检测喉癌Hep-2细胞与RNAi细胞中CD133+细胞率并进行分选。培养观察分选后的细胞,Real-time PCR定量检测两组细胞中CD133的相对表达量,以及干细胞基因Notch2和PTEN的相对表达量。 结果BMI1和CD133在喉癌标本中共同表达,其中CD133在细胞膜上表达,BMIl主要在CD133+细胞的细胞核中。Real-time PCR结果显示BMI1在CD133+细胞中的表达量显著高于CD133-细胞(p<0.01),而Notch2和PTEN在CD133+和CD133-细胞中的表达量没有统计学差异。 结论BMI1与CD133在喉鳞状细胞癌中共同表达,并且BMI1主要表达于CD133+喉癌干细胞中对其发挥作用。Notch2和PTEN对于CD133+喉癌干细胞没有特异性作用。 第四部分BMI1基因对于人喉癌Hep-2细胞系肿瘤干细胞的作用 目的探讨BMI1基因对于CD133+喉癌干细胞的作用以及对于相关基因和信号通路的影响。 方法流式细胞仪检测Hep-2细胞和RNAi细胞中CD133+喉癌干细胞的含量并分选。培养分选后的CD133+干细胞,比较成球能力。Real-time PCR检测Hep-2和RNAi细胞中CD133的相对表达量以及BMI1相关基因p53、p16和cyclinD1的表达量,分析对信号通路的影响。 结果流式细胞仪检测结果显示RNAi细胞中CD133+细胞的含量明显比Hep-2细胞少(p<0.01)。分选后细胞培养观察发现Hep2-CD133+细胞的生长速度和成球能力明显比RNAi-CD133+细胞强。Real-time PCR结果显示RNAi细胞中CD133的表达量显著减少(p<0.01),同时在RNAi细胞中,p53、p16的表达量显著增加(p<0.05),cyclinD1的表达量显著减少(p<0.01)。 结论BMI1沉默导致了CD133+喉癌干细胞的减少,从而抑制了肿瘤细胞的增殖、促进其凋亡并且减弱了对放化疗的耐受性,同时BMI1对INK4A/ARF/P53信号通路的调控发挥重要作用。
收起
(8.0+极速模式)