[1]上海中医药大学龙华医院脊柱病研究所,上海 200032
[2]复旦大学肿瘤医院中心实验室,上海 200433
目的:构建具有细胞性穿透性的9R-Sox2蛋白的重组质粒,使其在293T细胞中表达,并对所表达的9R-Sox2蛋白的功能进行鉴定。方法:从小鼠胚胎干细胞中扩增Sox2基因,并且在其N端加上9个精氨酸短肽,此融合基因连接到pPYCAG载体上,pPYCAG-9R-Sox2和pPYCAG分别转染到293T细胞中。3d后,对转染细胞用嘌呤霉素筛选,1周后筛选得到阳性克隆细胞株,对其进行细胞免疫荧光鉴定。表达9R-Sox2蛋白的细胞株进行裂解,取细胞裂解液加入至小鼠胚胎成纤维细胞的培养基中进行通透。48h后,小鼠胚胎成纤维细胞进行细胞免疫荧光检测,并提取蛋白Western blot检测PCNA表达。结果:用Sox2抗体进行细胞免疫荧光鉴定,结果均显示所有细胞表达9R-Sox2。在细胞裂解液处理的成纤维细胞,细胞免疫荧光结果显示9R-Sox2蛋白定位在细胞核,表明9R-Sox2构建和翻译正确。同时经含9R-Sox2的细胞裂解液处理的成纤维细胞,PCNA表达明显上调。结论:成功构建表达9R-Sox2融合蛋白的pPYCAG-9R-Sox2重组质粒,并证明具有细胞通透及促细胞增殖功能。
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