研究背景：<br> 黑素细胞是一类特定的黑素生成细胞，其起源于外胚层的神经嵴，成熟的黑素细胞在脊椎生物体的皮肤、毛发、眼睛等的色素呈现中起着决定性作用。黑素细胞所生成的黑素过多、过少或缺乏可引起诸如白癜风、黄褐斑等多种色素障碍性皮肤病。所以，对于色素性疾病的基础和临床研究来说，有关黑素细胞的发育调控过程的研究是个提纲挈领的切入点。近年来随着各类干细胞生物学相关技术的不断成熟，进一步从干细胞的角度出发，探索黑素细胞前体阶段向成熟黑素细胞发育分化的过程和机制，对于探讨诸如白癜风之类的色素性疾病的发病机理，以及寻找新的治疗靶点，或许都将是个有益的尝试。<br> 近年来已有众多研究证实毛囊部外毛根部隆突区域存在神经嵴来源的多能成体干细胞，我们简称为毛囊部神经嵴干细胞(HF-NCSCs)。HF-NCSCs能进行自我更新，同时处于未分化的原始阶段，在一定条件下可分化成黑素细胞、感觉神经元、间质细胞等特定组织类型。因此，利用HF-NCSCs模型，有助于我们深入研究从神经嵴干细胞阶段→黑素前体细胞阶段(黑素干细胞-黑素母细胞)→黑素细胞阶段的发育分化过程和调控机制，为理解色素性疾病的发生、发展和恢复提供新的理论依据和新的思路。<br> 具体联系到临床，我们知道光疗(如NB-UVB)治疗白癜风皮损后，患者色素的恢复呈现典型的以毛囊为中心向四周扩展(点状型)的方式。这种复色过程的本质可能与HF-NCSCs向成熟MC细胞的分化发育密切相关。此外，我们注意到近年来涌现出的308nm准分子激光在临床应用中较NB-UVB治疗白癜风的疗效更为确切快捷。但是，尽管NB-UVB/308nm准分子激光临床疗效确切，相关的临床回顾性研究也较多，但有关NB-UVB以及308nm准分子激光治疗白癜风的机制方面的研究却少有报道，相关的治疗机理尚待进一步明确。<br> 研究目的：<br> 本课题设想以HF-NCSCs为细胞模型，结合临床，拟开展有关NB-UVB以及308nm准分子激光对体外培养的HF-NCSCs向MC系定向分化的影响及相关机制的实验研究。<br> 研究方法：<br> HF-NCSCs取材于C57BL/6小鼠触须的外毛根鞘隆突区域，酶消化法得到单细胞悬液，置于神经嵴干细胞增殖培养基中培养。以RT-PCR来鉴定它们的神经嵴干细胞标志物的表达；以免疫荧光来检测在各种特定培养液诱导下各种定向分化的细胞所含的特异性抗体的表达，尤其是向MC定向分化的特异标志物的表达。<br> 接下来，我们以0.1～0.6J剂量范围内的NB-UVB或308nm准分子激光照射HF-NCSCs，并换用MC特定培养基培养一定时间后，依次评估对定向分化的黑素细胞系的细胞活性、分化能力和迁移能力的影响。我们用细胞计数的方法比较对HF-NCSCs分化的黑素细胞系的细胞活性的影响。用免疫荧光、多巴染色、络氨酸酶活性反应、Realtime-PCR和Western blot等多种方法检测NB-UVB对HF-NCSCs分化的MC系的细胞成熟度的影响。用Transwell小室检测NB-UVB对HF-NCSCs向MC系分化过程中的细胞迁移能力的影响。<br> 在进一步的有关NB-UVB对HF-NCSCs向MC系分化过程中调控机制的探讨方面，我们用Realtime-PCR检测NB-UVB对黑素细胞调控因子Mc1R、Kit、Fzd4、NT3R、Ednra、EP1、TGFβR、Notch1、Sox10、Mitf Lef1和Pax3等的表达变化；用Western blot检测Sox10、Mitf的蛋白表达变化；用Elisa检测了受NB-UVB照射后细胞上清液中SCF、α-MSH的含量。此外，我们进一步用cAMP-PKA信号通路的激动剂IBMX添加入培养液，观察其在NB-UVB对HF-NCSCs向MC系分化过程中的影响。<br> 在308nm准分子激光和NB-UVB对HF-NCSCs向黑素细胞系定向分化过程的比较研究部分，我们同样用细胞计数的方法观察两组对HF-NCSCs分化的黑素细胞系的细胞活性的影响；用Realtime-PCR检测两组受照射后分化而来的黑素细胞Tyro、Tyrp1、Tyrp2等的表达差异；用Elisa和Realtime-PCR检测两组受照射后分化而来的MC系细胞上清液中SCF、α-MSH的含量，以及Mc1R、Kit、Sox10等的表达变化<br> 研究结果：<br> 一、HF-NCSCs的培养鉴定及向黑素细胞系的定向分化<br> 从小鼠触须的毛囊隆突部位分离培养得到的HF-NCSCs以悬浮状态或贴壁状态呈克隆性生长。悬浮状态克隆性生长时，细胞形态显示为特征性的三维球体样结构。RT-PCR显示，它们表达多种NCSC特异性标志物如Nestin、p75、Sox10、Snail-1、Twist-1等，一些皮肤组织来源的干细胞标志物如Myo10、Msx2，以及一些通用干细胞的标志物如K1f4和Wnt1等。在特定培养液诱导下，HF-NCSCs均可以定向分化成黑素细胞、平滑肌细胞、神经元等多种细胞类型。<br> 在本课题主要关注的HF-NCSCs往黑素细胞系定向分化这条主线上，我们以HF-NCSC为种子细胞，经过1～2周的特定黑素细胞培养液的诱导培养，所得到的分化细胞呈现类似正常MC的双极树突或多极树突外观。更重要的是，部分分化细胞呈多巴反应阳性，并表达MC特异标志物Mitf、Tyro，表明所得到的分化细胞符合黑素细胞或黑素母细胞的相关特征。<br> 二、NB-UVB对HF-NCSCs向黑素细胞系定向分化的干预研究<br> 在0.1～0.6J剂量范围内，随着照射剂量增大，NB-UVB对HF-NCSCs分化的MC系细胞的增殖呈现抑制作用。在HF-NCSCs向MC系定向分化过程中细胞的成熟度方面，NB-UVB作用能逐渐增加由HF-NCSCs分化的MC
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