目的：探索大鼠肌卫星细胞体外培养的技术方法,并观察其体外增殖、分化的特征。将体外培养的肌卫星细胞移植至失神经支配的骨骼肌,观察其体内存活,分化,及形成肌管的过程,并评判肌卫星细胞移植对于延缓失神经骨骼肌萎缩的作用。 方法： 第一部分：大鼠肌卫星细胞的体外培养与鉴定 以成年Wistar大鼠后肢肌为取材组织,采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶,以“两步法”消化分离肌卫星细胞,并采用差速贴壁法纯化。培养肌卫星细胞的增殖培养基采用Ham"s F10+20%FBS+5ng/ml bFGF,分化培养基采用Ham sF10+2%FBS+2%HS。观察体外培养的肌卫星细胞增殖、分化及融合形成肌管的状态。 采用免疫荧光技术,对静止和激活的肌卫星细胞分别选择其特征性标志物PAX7和MyoD为标志,对分化肌细胞选择肌细胞骨架蛋白Desmin和a-SCA为标志,分别进行细胞鉴定。 第二部分：肌卫星细胞移植与体内分化的观察 体外培养的肌卫星细胞经纯度鉴定之后,以带e-GFP基因的腺病毒转染示踪,并移植至失去胫神经支配之腓肠肌。分别在移植之后1周、2周、4周取材腓肠肌组织,制作连续冰冻切片。荧光显微镜下观察,带GFP绿色荧光的移植细胞存活、分化及形成肌管的状态。 第三部分：肌卫星细胞移植延缓失神经肌萎的疗效观察 选取成年Wistar大鼠24只,于右后肢切断胫神经,建立失神经肌萎模型。将其随机分为两组,其中12只Wistar大鼠于右侧腓肠肌注射肌卫星细胞悬液(移植组),另外12只仅注射细胞培养液(对照组)。 移植4周后,选取移植组与对照组各6只大鼠,取材双侧腓肠肌,称肌湿重后,制作石蜡切片,行HE染色与Masson染色,比较肌纤维平均截面积与胶原纤维增生状态。剩余大鼠取材右侧腓肠肌,制作冰冻切片,行ATP酶组织化学染色,比较移植组和对照组肌组织中ATP酶的含量。 结果：采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶联合消化,并用差速贴壁法纯化的方法,可在体外获得高纯度的大鼠肌卫星细胞。体外培养的大鼠肌卫星细胞可在合适条件下分化,并相互融合形成肌管。培养所得细胞在分化前表达静止期肌卫星细胞特征性标志物Pax7,在激活后表达MyoD,在分化后表达肌细胞特有骨架蛋白Desmin(结蛋白)和α-SCA(α横纹肌肌动蛋白)。 外源性肌卫星细胞移植后,可在肌组织内存活、分化、相互融合形成肌管。肌卫星细胞移植组的腓肠肌,在肌湿重、肌纤维平均截面积、胶原纤维增生及ATP酶改变各方面,均较对照组有改善,其差异具有统计学意义。 结论：通过分离消化大鼠肌组织,可在体外获得高纯度的具有成肌能力的肌卫星细胞。将肌卫星细胞移植于失神经支配的骨骼肌,能够发挥延缓肌肉萎缩的作用。
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