目的:从细胞层面探讨Klotho基因超甲基化在硫酸吲哚酚(IS)诱导的血管平滑肌细胞成骨转化中的作用和相关机制。方法:体外培养人主动脉血管平滑肌细胞(HASMC),以IS按0、200、500、1000μmol/L的浓度梯度干预6d,采用茜素红染色观察钙盐沉积,Real-time聚合酶链式反应(PCR)和Western印迹检测平滑肌细胞肌动蛋白α(α-SMA)、smoothin、骨桥蛋白(OPN)、碱性磷酸酶(ALP)、核结合因子d1(CbfM)、Klotho和不同DNA甲基化转移酶(DNMT)的mRNA和蛋白表达水平,同时利用焦磷酸测序方法检测HASMC的Klotho基因甲基化率;在IS1000Ixmol/L组培养基中加入不同浓度梯度的5-氮杂脱氧胞苷(5Aza-2de)进行干预,观察茜素红染色、各基因表达水平和Klotho基因甲基化率的改变。组间均数比较采用独立样本t检验,组间率的比较采用卡方检验。结果:IS1000μmol/L组HASMC细胞外基质呈红色,细胞结节处浓染,为钙盐沉积染色阳性。IS可以下调HASMC的仪.SMAmRNA和蛋白及smoothin表达水平,上调OPN、ALP的mRNA和蛋白表达水平,使HASMC逐渐丧失平滑肌细胞表型而发生成骨转化。与对照组比较,IS200、500、1000μmol/L刺激6d可显著升高HASMC的Klotho基因甲基化率(94-1%与4±±7%,t=5.38,P<0.01;18±1.3与4±0.7%,t=6.92,P<0.01;41±2%与4±0.7%,t=9.26,P<0.001)。IS500、1000μmol/L可显著下调HASMC的KlothomRNA和蛋白表达水平。同时IS1000μmol/L可显著上调HASMC的DNMT1mRNA和蛋白表达水平。5Aza-2dc10Ixmol/L干预可减轻Is诱导的细胞外钙盐沉积,上调α-SMA蛋白、smoothin表达水平并下调cbfod蛋白表达水平,同时减低HASMC的Klotho基因甲基化率(204-1%与41±2%,t=6.98,P<0.01)、上调HASMC的Klotho蛋白表达水平。结论:S可通过上调血管平滑肌细胞DNMT表达,启动Klotho基因超甲基化,进而下调Klotho基因转录和表达,诱导血管平滑肌细胞成骨转化。
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