目的探讨靶向乙型肝炎病毒(HBV)preC/C基因的小干扰RNA(siRNA)在人类肝癌细胞系Huh-7细胞和HepG2.2.15细胞中抗病毒基因治疗效果。方法根据GenBank中HBV(GenBank登录号U95551)基因组序列,设计合成靶向HBV preC/C基因的3个长21核苷酸(nt)的siRNA,随机设计1个非同源对照21nt的siRNA,分别克隆到pU6质粒中,构建3个shRNA表达载体pU6-C1,pU6-C2,pU6-C3和对照pU6-C4;为了检测siRNA功能建立报告基因系统,以pT-HBV1.3为模板,PCR合成目的基因preC/C,克隆到绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体(pEGFP-N1)中构建携带EGFP报告基因的重组质粒pEGFP-preC/C(E-C)。将构建的3个shRNA表达载体与E-C共转染Huh-7细胞,或将该3个shRNA表达载体共转染HepG2.2.15细胞。首先,在Huh-7细胞中使用荧光显微镜观察及流式细胞仪检测EGFP融合表达细胞计数,评估该shRNA在转染后不同时间对EGFP融合报告基因表达的抑制效应;接着在HepG2.2.15细胞中,运用ELISA检测转染后24h,48h,72h和96h细胞上清中HBsAg和HBeAg的表达量;免疫荧光技术检测转染后72h细胞内HBsAg和HBcAg的表达水平;实时荧光定量PCR(real-time PCR)进一步检测HBVmRNA转录产物cDNA的拷贝变化。结果发现siRNA表达质粒与E-C共转染Huh-7细胞后48h,与pEGFP-N 1单质粒转染相比,pU6-C1,pU6-C2或pU6-C3共转染组使EGFP表达水平降低80%,而对照pU6-C4或pU6共转染组无显著降低EGFP的表达,差异有统计学意义(P<0.01);免疫荧光技术检测发现HepG2.2.15细胞内HBsAg和HBcAg表达显著降低,real-time PCR发现pU6-C1、pU6-C2或pU6-C3共转染HepG2.2.15细胞后48h,使mRNA转录产物的cDNA含量分别降低了73.9±1.2%(P=0.029)、48.2±1.8%和35.8±1.4%(P=0.037,0.040),而不论pU6-C4或pU6对照共转染组均不能降低cDNA含量,差异均有统计学意义(P<0.01);发现pU6-C1结果与显微镜观察/流式细胞仪细胞计数、ELISA和免疫荧光技术检测结果相吻合。抗病毒效果48h后作用明显,72h达到高峰。结论发现靶向preC/C基因的RNAi能够有效特异抗HBV在人类肝癌细胞系中复制与表达。RNAi可能成为抗重大传染病HBV/HCV/HIV有效的基因治疗技术。
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