[1]广东省粤北人民医院/汕头大学医学院附属粤北人民医院骨科,广东省韶关市 512026
[2]上海复旦大学遗传生物研究所
[3]汕头大学医学院研究生院
目的:探讨细胞因子BMP4在骨膜来源细胞体外培养中的定向成软骨分化作用。方法:采用人胫骨骨膜为材料,体外组织块法分离骨膜来源细胞,置于DMEM/F12完全培养基培养,倒置显微镜观察细胞形态,台盼蓝染色细胞计数法检测第3、9代骨膜来源细胞和BMP4诱导后细胞的增殖活性,绘制细胞生长曲线图。随机分为对照组、软骨诱导组和实验组,分别加入完全培养基、软骨诱导液和BMP4加软骨诱导液,第14和21天分别采用甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色检测细胞的蛋白多糖和Ⅱ型胶原;定量PCR检测软骨基因Aggrecan、Ⅱ型胶原和SOX9mRNA表达。结果:(1)骨膜来源细胞在体外贴壁生长,经成软骨诱导1周后可见类圆形细胞形成,2周后细胞呈多角形,甲苯胺蓝染色呈阳性;细胞生长曲线证实诱导分化后细胞与第3代至第9代细胞增殖能力相似。(2)第14和21天软骨细胞标志物阳性率(%)实验组蛋白多糖(分别为40.29±4.29、56.74±5.12)和Ⅱ型胶原(分别为19.27±3.71、38.31±4.25)较软骨诱导组(第14和21天蛋白多糖分别为28.12±3.25、41.23±4.18,11型胶原分别为10.24±1.21、15.28±2.23)明显升高(P<0.05)。(3)定量PCR:实验组Aggrecan(25.76-t-0.57)、Ⅱ型胶原(6.48±0.48)、SOX9(2.91±0.18)mRNA表达均明显高于软骨诱导组(11.12±0.38、2.24±0.41、1.54±0.35)和对照组(2.37±0.24、1.12±0.31、1.07±0.22)(P<0.05)。结论:骨膜来源细胞体外增殖能力强,经诱导可定向成软骨分化,BMP4在体外具有明显促进骨膜来源细胞分化为软骨细胞的作用。
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