乙醛脱氢酶2(ALDH2)促进慢性缺血组织血管新生作用的基础与临床研究  学位论文  

前言 缺血性心脏病是人类健康主要杀手之一。据统计,美国20岁以上成年缺血性心脏病总患病率为7.0%,是死亡最常见原因之一[1,2]。在我国,随着经济增长和生活水平的提高,缺血性心脏病的患病率和死亡率逐年上升。尽管药物治疗、介入治疗、外科手术治疗取得了很大进步,但约20%患者不能进行这类治疗或者治疗效果不佳[3]。临床研究已证实良好的侧枝循环可以保护缺血心肌,提高缺血性心脏病病人的生存率[4,5]。如何促进侧枝循环的建立已成为目前防治缺血性心脏病的一大热点。严重缺血性心脏病患者中,血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)、缺氧诱导因子-1α (Hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)已被证实能促进侧枝循环的形成[6,7]。 乙醛脱氢酶2(Aldehyde dehydrogenase, ALDH2)位于线粒体,是一种主要的醛类氧化酶。ALDH2基因存在一些常见突变,东亚人群中Glu504Lys突变具有很高的出现频率,在中国汉族人群中携带者约为34%,日本人群中约占46%。携带该突变将引起个体酶活性降低,杂合子仅为野生型个体ALDH2活性的十六分之一,突变纯合子体内几乎没有该酶活性[8,9]。早期主要认为ALDH2主要是酒精代谢中的关键酶,催化具有毒性的乙醛代谢为无毒性的乙酸的反应,乙酸在体内可以继续参与供能反应。2008年Science报道,ALDH2通过激活蛋白激酶Cε (Protein kinase Cε,PKCε)途径,在缺血再灌注损伤模型中发挥显著保护作用[10]。近年来,ALDH2逐渐被被证实为一种重要的内源性心脏保护因子,在心梗后心衰、心脏缺血再灌注损伤、酒精性心肌病等方面发挥重要保护作用[11]。 本实验室前期研究发现：ALDH2可以对心梗后慢性缺血心肌发挥保护作用,这是通过减少脂质过氧化产物毒性醛类物质如4-羟基壬烯醛(4-Hydroxynonenal,4-HNE)的产生,从而抑制JNK/p53途径来实现。2007年Nature有文章表明[12],主动脉缩窄引起的心脏压力负荷模型中,心肌细胞肥大而与之匹配的血管新生不足,导致心肌细胞相对缺血,p53通过下调HIF-1α抑制血管新生,加重心肌缺血使心功能进一步恶化；反之,抑制p53能通过促进心肌细胞周围血管新生,有效改善心肌供血,从而提高小鼠心脏射血分数。因此,ALDH2是否参与调控血管新生?同时,ALDH2参与线粒体活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的产生[13],而ROS亦可以调控HIF-1/VEGF途径[14]。因此本研究将从血管新生的角度研究,ALDH2作为一种内源性缺血保护因子,是否通过HIF-1/VEGF途径在慢性缺血过程中调控血管新生,从而改善组织血供代偿,促进缺血组织功能。 冠状动脉慢性闭塞病变(Coronary total occlusion, CTO)由于病变的严重程度和复杂程度,具有难治性,被认为是冠脉介入治疗领域“最后的前沿”,侧枝循环的形成对CTO患者维持基础心功能至关重要[15]。考虑到ALDH2在亚洲人中具有接近半数的突变携带率,因此ALDH2基因型对CTO患者的侧枝循环形成能力的作用,对于临床工作中CTO病变高危人群的预防、治疗策略的选择和预后判断都将具有重要意义。本研究将通过收集CTO患者,来研究ALDH2基因分型和与其冠脉侧枝循环Rentrop分级的关系及其临床影响因素,从而说明ALDH2在临床缺血性心肌病中的作用。 综上所述,本研究旨在研究ALDH2对慢性缺血组织血管新生的作用,并进一步阐明其分子作用机制,并通过对ALDH2基因型与CTO患者冠状动脉侧枝循环关系的临床研究来验证ALDH2对血管新生的作用和在人群中特别是东亚人群中的影响。本研究有望从血管新生角度探讨出ALDH2对慢性缺血心肌发挥保护的作用机制,阐明ALDH2基因型差异对CTO患者临床表型及预后的影响,并有望为此类患者的个体化治疗原则提供参考依据,如对ALDH2缺失型患者采取更积极的血运重建。全文共分为以下三部分： 第一部分ALDH2调控慢性缺血组织的血管新生能力 背景血管新生对于缺血性心脏病的发展和预后至关重要,乙醛脱氢酶2(Aldehyde dehydrogenase, ALDH2)的心肌保护作用近年来备受关注,本研究旨在探索ALDH2对慢性缺血组织血管新生的调节作用。 方法动物实验,采用8周雄性ALDH2基因敲除小鼠(ALDH2-KO)和野生型C57BL/6小鼠(WT)制作下肢缺血模型,于术后1天、7天和21天用激光多普勒仪测量下肢血流灌注水平。细胞水平实验,培养大鼠心肌微血管内皮细胞(Microvascular endothelial cells, MECs),通过转染ALDH2-siRNA建立ALDH2低表达细胞；分别设立正常氧分压组和缺氧发生剂模拟缺氧6小时组,通过Metrigel胶培养观察各组微血管内皮细胞的成管能力。 结果动物实验,激光多普勒检测以小鼠健测为对照统计患侧/健侧血流灌注比,发现ALDH2-KO小鼠下肢血流恢复水平比野生型小鼠更差,21天时具有显著统计学差异(p<0.05)。ALDH2-KO小鼠腓肠肌萎缩更加显著,并且免疫组化显示ALDH2-KO小鼠缺血区域的小动脉新生少。细胞水平实验,观察到对大鼠心肌MECs给予ALDH2-siRNA干扰后,在正常氧分压组及缺氧6小时组,与对照组相比ALDH2低表达细胞Metrigel胶成管能力显著减弱。 结论上述结果说明,ALDH2缺陷能够抑制慢性缺血组织的血管新生,阻碍自身血运重建和功能重建。从血管新生的角度解释了ALDH2对慢性缺血心肌的保护作用,为临床缺血性疾病治疗提供新的药物作用靶点。 第二部分ALDH2通过上调HIF-1α/VEGF途径促进血管新生 背景近年来,ALDH2逐渐被被证实为一种重要的内源性心脏保护因子,在心梗后心衰、心脏缺血再灌注损伤、酒精性心肌病等方面发挥非常关键的保护作用。第一部分研究发现ALDH2缺陷能够显著减弱慢性缺血组织的血管新生,本研究旨在阐明其内在分子机制。 方法动物实验,分组及造模同第一部分,分别取术后1天、7天和21天小鼠双侧股四头肌提蛋白。细胞实验,培养人脐静脉内皮细胞细胞系(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)进行信号通路的研究,通过转染病毒建立ALDH2低表达及高表达细胞模型,设立正常氧分压组和缺氧6小时组。分别对上述小鼠股四头肌组织和细胞,采用Western Blot方法检测ALDH2、缺氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)等蛋白表达水平。 结果动物实验,Western Blot检测发现,ALDH2-KO小鼠缺血侧股四头肌组织在缺血后1周时与野生型小鼠相比,HIF-1α和VEGF蛋白水平显著降低(p<0.05)。培养HUVECs细胞进行Western Blot检测发现,上调ALDH2的表达,HIF-1α、VEGF蛋白水平增加；而转染质粒抑制ALDH2表达,则HIF-1α、VEGF蛋白水平显著降低。 结论上述结果说明,ALDH2能够通过调节HIF-1α/VEGF通路,对慢性缺血组织的血管新生发挥调节作用,从而通过改善缺血组织血供促进功能重建。本研究解释了ALDH2调控血管新生的内在分子机制。 第三部分ALDH2基因型对CTO患者冠状动脉侧枝循环分级的临床研究 背景冠状动脉慢性闭塞病变(Coronary total occlusion, CTO)被认为是冠脉介入治疗领域“最后的前沿”,冠状动脉侧枝循环(Coronary collateral vessels, CCVs)的形成对CTO患者维持基础心功能至关重要。ALDH2Glu504Lys突变在亚洲人群中具有接近半数的突变携带率。本研究旨在从临床的角度,阐明ALDH2基因型对慢性缺血心肌血管新生作用。 方法通过中山医院伦理审查和获得患者同意后,从在上海中山医院进行冠状动脉造影的患者中,选择收集冠状动脉慢性闭塞病变(Chronic total occlusion, CTO)患者；入选条件：左主干、左前降支、回旋支和／或右冠状动脉至少一支完全闭塞,病程大于等于3个月；排除条件：急性心肌梗塞(acute myocardial infarction, AMI),经皮冠状动脉介入治疗(Percutaneous coronary intervention, PCI)术后,冠状动脉旁路移植术(Coronary artery bypass grafting, CABG)术后,或合并先心、瓣膜病和外周血管疾病等。根据患者冠脉造影图像进行侧枝循环Rentrop分级(0级和1级合并为侧枝循环不良组,2级和3级合并为侧枝循环良好组),对ALDH2基因测序分型,收集患者临床资料,采用SPSS16.0软件进行统计分析。 结果根据入选和排除条件共有153名CTO患者纳入研究,发现在ALDH2野生型中(n=83)侧枝循不良者占38.5%；突变杂合型携带患者中(n=63)侧枝不良者占44.4%；而在突变纯合型携带患者中(n=7)侧枝不良者(n=5)占71.4%,与野生型和杂合型相比侧枝循环更差(p<0.05)。 结论上述结果从临床水平亦证明ALDH2活性对血管新生十分重要。并且临床中在慢性缺血性心脏病病患者中,ALDH2缺陷的个体显示出了更差的心脏侧枝循环形成能力,Glu504Lys突变纯合型个体(占亚洲人口的6-10%)。本研究为临床对携带ALDH2突变的CTO患者采取更加积极的血运重建治疗策略提供理论依据。