多肽介导的纳米递释系统靶向治疗脑胶质瘤研究  学位论文  

神经胶质瘤占脑部肿瘤发病数的40%左右,是颅内最常见的恶性肿瘤。临床上传统治疗方法为手术切除,但因为脑肿瘤部位接近患者的中枢神经,手术难以完全清除而易导致肿瘤复发。化疗是脑胶质瘤诸多治疗环节中至关重要的一环,其成败直接影响病人的生活质量和预后。然而,由于血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)和血瘤屏障(blood-brain tumor barrier, BTB)的存在限制了药物向胶质瘤内部的递送,同时药物较弱的渗透能力和入胞效率使肿瘤细胞内药物浓度过低,导致目前临床化疗效果极其不理想。因此有效地增加胶质瘤组织中抗肿瘤药物的浓度,并提高药物的细胞内化是提高化疗药物疗效的关键。 针对于此,本课题设计和构建了两种新型的纳米递释系统：(1)以可活化(触发式)低分子量鱼精蛋白(activatable low-molecular-weight protamine, ALMWP)为靶向配体的肿瘤微环境酶响应型药物递送系统,以期解决吸附介导的胶质瘤靶向递药系统缺乏细胞选择性问题；(2)以MT1-AF7p肽修饰聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)纳米粒联合肿瘤穿透肽iRGD共同注射构建的共给药纳米递药系统,以期解决受体介导的胶质瘤靶向递药研究中靶向效率低的问题。通过两种不同的策略来探索具有高度胶质瘤血管穿透和肿瘤渗透能力的纳米递药系统,用于提高胶质瘤的治疗效果。 本文第一部分构建了以可活化(触发式)低分子量鱼精蛋白(activatable low-molecular-weight protamine, ALMWP)为靶向配体的肿瘤微环境酶响应型药物递送系统。低分子量鱼精蛋白(low molecular weight protamine, LMWP)是一种具有广阔应用前景的细胞穿膜肽,具有与人免疫缺陷病毒(HIV)的转录活化因子Tat蛋白相似的穿膜性质,能介导递释系统高效入胞,但是其靶向性差,几乎对所用细胞都有作用。在本研究中我们结合了在胶质瘤的血管内皮细胞及肿瘤细胞均高表达的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP) MMP-2和MMP-9,以及穿膜肽LMWP能介导纳米递释系统高效入胞的特点,设计了一种新型的可活化穿膜肽ALMWP。ALMWP包括三部分：一为穿膜肽低分子量鱼精蛋白(low molecular weight protamine, LMWP)部分,其带正电荷并具有强大的穿膜能力和运载潜能；二为负电性的阴离子肽段部分,能中和穿膜肽的正电荷；三为连接部分,选择能被MMP-2/9高效切割的基质肽PLGLAG作为连接肽段。在本研究中,我们采用将ALMWP修饰到包载紫杉醇(Paclitaxel, PTX)的聚乙二醇聚-己内酯(PEG-PCL)纳米粒表面(ALMWP-NP-PTX)用于脑胶质瘤的靶向治疗研究,该系统具有以下特性：(1) ALMWP在未被切割之前整体电荷保持中性,将其修饰到纳米递释系统上不会改变其电位,体内给予后仍然保持纳米粒的长循环性质；(2)纳米粒到达肿瘤部位后,由于肿瘤部位高度表达金属基质蛋白酶,能高效切割PLGLAG序列而使阴离子部分解离,阳离子部分暴露而发挥强大穿膜作用,从而使纳米粒大量被肿瘤细胞所摄取。 这部分的研究中,首先通过开环聚合法合成纳米材料聚乙二醇聚己内酯(MPEG-PCL)和马来酰亚胺聚乙二醇聚己内酯(Maleimide-PEG-PCL)并采用乳化溶媒蒸发法制备包载PTX的纳米粒(NP-PTX),利用马来酰亚胺基特异性反应构建ALMWP修饰的载紫杉醇纳米粒(ALMWP-NP-PTX)。制得的ALMWP-NP-PTX大小均匀,形态圆整,平均粒径为121nm,Zeta电位为-21.8mV。细胞摄取结果显示,与普通纳米粒相比,ALMWP修饰的靶向纳米粒显著增加了C6胶质瘤细胞的摄取,并且其摄取过程是MMP-2/9依赖的,可被MMP抑制剂metastat抑制。C6肿瘤球渗透实验结果也表明ALMWP-NP可显著增强纳米粒对实体肿瘤的渗透能力。摄取抑制实验结果表明ALMWP-NP的内吞需要能量,通过巨胞饮和脂筏介导的两种内吞途径入胞,并且内吞过程有高尔基体和酸性溶酶体参与。药动学结果显示ALMWP-NP-PTX组的AUC是LMWP-NP-PTX组的4.7倍(p<0.001),清除率(CL)相对于LMWP-NP-PTX组显著降低(p<0.001)。与LMWP-NP-PTX相比,ALMWP-NP-PTX的体内药动学行为得到明显改善：LMWP-NP-PTX由于其较强的正电荷而使其的非特异性摄取增加,血浆中的滞留时间显著变短,而ALMWP-NP-PTX与NP-PTX的体内长循环效果相当,各药动学参数无显著性差别。荷C6异位皮下瘤裸鼠的组织分布结果表明,ALMWP-NP显著的增加了PTX在肿瘤部位的蓄积,其在各时间点肿瘤组织中PTX浓度分别为Taxol组浓度的2.31,3.73,2.90,2.20,2.77,2.86倍；NP组的2.02,2.49,2.40,1.79,2.49,2.74倍；LMWP-NP组的1.65,1.90,2.18,2.28,3.07,3.21倍。ALMWP-NP组在显著增加肿瘤部位药物浓度的同时,在非靶器官的蓄积和NP组无显著性差异。荷原位C6脑胶质瘤的裸鼠活体成像结果证明,在纳米粒表面修饰ALMWP可明显增加其在体内胶质瘤中的蓄积。荷原位瘤脑组织的冰冻切片实验结果显示在纳米粒表面修饰ALMWP可明显增加其在体内脑胶质瘤部位的蓄积和渗透。细胞毒结果显示,ALMWP修饰的纳米粒显著增大了PTX对胶质瘤细胞的毒性作用。荷C6原位瘤小鼠的药效学结果显示,ALMWP-NP-PTX组的平均生存时间为48天,显著高于生理盐水组(20.5天)(p<0.01,log-rank analysis),Taxol组(24天)(p<0.01),NP-PTX组(30天)(p<0.01)和LMWP-NP-PTX组(34.5天)(p<0.05)。 本文第二部分以MT1-AF7p肽修饰聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)纳米粒联合肿瘤穿透肽iRGD构建共给药纳米递释系统。膜型基质金属蛋白酶-1(membrane type1-matrix metalloproteinase, MT1-MMP)在胶质瘤的血管生成和侵袭等过程中发挥重要作用。MT1-MMP在脑胶质瘤细胞和新生血管内皮细胞上均高表达,其表达量随脑胶质瘤恶性程度增加而增加,因此可作为临床预后判断的依据和临床治疗的靶点。MT1-AF7p肽是通过噬菌体展示技术筛选出来的含13个氨基酸的短肽,对MT1-MMP具有特异的亲和性。本研究将MT1-AF7p肽修饰在包载PTX的聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)纳米粒表面(MT1-NP-PTX),通过胶质瘤细胞和肿瘤新生血管内皮细胞上均高表达的MT1-MMP介导增加纳米粒的胶质瘤主动靶向能力。iRGD肽(CRGDK/RGPDC)通过与肿瘤血管内皮特殊表达的av整合素相结合从而定位于肿瘤,随后在肿瘤中分裂成CRGDK/R,进一步结合神经纤毛蛋白Neuropilin-1(NRP-1). CRGDK/R与NRP-1的结合调控着一种激活的运输系统,让同时注射的药物从血管中渗出,从而调节药物的一种特殊的肿瘤组织渗透性。为了提高递药系统的胶质瘤靶向效率,本研究将MT1-AF7p肽修饰的PEG-PLA纳米粒联合iRGD肽共同注射构建共给药系统,以克服BTB的阻碍作用,进一步增加纳米粒透过胶质瘤血管的能力和在肿瘤部位的蓄积。 采用乳化溶媒蒸发法制备包载PTX的PEG-PLA纳米粒(NP-PTX),并通过纳米粒表面的马来酰亚胺基团将MT1-AF7p共价结合到纳米粒表面。制备的MT1-NP-PTX粒径在131nm左右,Zeta电位一31.43mV,纳米粒表面MT1-AF7p肽的连接数目为317。C6细胞摄取的定性结果显示,其对MT1-NP的摄取显著高于NP。细胞摄取的定量结果显示,C6细胞对MT1-NP的摄取呈现时间、浓度和温度依赖性,说明其对MT1-NP的摄取是一个主动转运过程。摄取抑制实验结果表明MT1-NP的内吞需要能量,主要通过巨胞饮和脂筏介导的两种内吞途径入胞,并且内吞过程有高尔基体参与。通过C6细胞毒和细胞凋亡等实验表明MT1-AF7p肽修饰的纳米粒显著增大了PTX对胶质瘤细胞的抑制作用。体外C6细胞三维肿瘤球模型评价结果表明MT1-AF7p肽的修饰显著增强了纳米粒对实体肿瘤的渗透能力和抑制能力。通过荷C6原位瘤小鼠的体内实验评价共给药系统的胶质瘤体内靶向性。小动物活体成像和脑组织的冰冻切片结果显示,MT1-AF7p肽的修饰和iRGD太的共给药显著提高了纳米粒穿过肿瘤血管的能力和在胶质瘤部位的蓄积。原位胶质瘤裸鼠的生存时间考察结果显示,共给药组(MT1-NP-PTX+iRGD)的平均生存时问为60天,显著高于Saline组(21天)(p<0.001,log-rank analysis),Taxol组(24天)(p<0.001),NP-PTX组(32天)(p<0.001),NP-PTX+iRGD组(40天)(p<0.01)和MT1-NP-PTX组(48天)(p<0.05)。