第一部分慢病毒载体构建、病毒包装和纯化 目的构建广谱(CMV)和特异性启动子(LEP503)调控的Lenti-HSV-tk载体，建立高效的慢病毒转基因平台。 方法利用分子克隆技术，将HSV-tk基因插入慢病毒载体Lenti-ires-EGFP中，构建广谱启动子CMV调控的HSV-tk基因表达的慢病毒载体(Lenti-CMV-HSVtk-EGFP)。应用PCR方法从人晶状体上皮细胞系(HLEC)基因组中克隆LEP503启动子序列，构建单纯LEP503启动子调控HSV-tk基因表达的慢病毒载体(Lenti-Lep503-HSVtk-EGFP)。利用慢病毒三质粒系统共转染293T细胞，包装病毒并收集上清液中病毒颗粒，感染晶体上皮细胞及其他细胞。 结果构建的慢病毒载体Lenti-CMV-HSVtk-EGFP能高效转染各类细胞并持续稳定的表达。在利用该慢病毒载体系统转染晶体上皮细胞时，我们发现当感染复数(MOI=100)时，转染效率接近100％，且传代培养6个月后仍能维持高转染效率。因此双基因共表达的慢病毒载体能高效稳定转染HLEC，为下一步的实验提供可靠的技术平台今。 第二部分Lenti-CMV-HSVtk／GCV对晶状体上皮细胞的杀伤实验研究 目的观察CMV调控的慢病毒介导HSV-tk／GCV系统对HLEC的杀伤效应，并研究其杀伤作用机制。 方法HSV—tk和报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)共表达的慢病毒感染细胞作为试验组，仪表达EGFP的慢病毒感染细胞和正常细胞作为对照组。流式细胞仪检测病毒的转染效率，荧光显微镜观察及基因组PCR和RT-PCR检测基因在HLEC内表达，DNA ladder和电镜观察HSV-tk／GCV系统对HLEC的杀伤作用，CCK—8试剂盒检测HSV-tk／GCV系统的浓度与时间依赖性及其旁观者效应。 结果慢病毒系统能使共表达的HSV—tk和EGFP高效整合入HLEC的基因组并高效表达。当GCV浓度为10～25ug／ml时，能明显诱导转染HSV—tk的HLEC凋亡或坏死，且随浓度的升高和时间的延长作用增强，同时存在明显的旁观者效应。在同样的GCV浓度范围内对照组EGFP转染细胞和正常细胞则无显著毒性，但当GCV浓度＞25ug／ml时，由于GCV的自身毒性对照组细胞的增殖也被显著抑制。 第三部分Lenti-LEP503-HSVtk／GCV在晶状体上皮细胞中表达的特异性及靶向杀伤作用 目的研究Lenti-LEP503-HSVtk-EGFP／GCV对HLEC的靶向性杀伤作用 方法分别以HLEC，Hela细胞为研究组，转入特异性表达载体Lenti-LEP03-HSVtk-EGFP，三天后荧光显微镜观察两组细胞荧光强度，并收集细胞作RT-PCR，判断其组织特异性表达情况。以HLEC为研究组，分别转入非特异性表达载体Lenti-CMV-HSVtk-EGFP和特异性表达载体Lenti-LEP503-HSVtk-EGFP，通过荧光显微镜观察、FACS及RT-PCR比较CMV与LEP503启动子间HSV-tk表达的差异。CCK-8检测两系统的杀伤作用差异。 结果Lenti-LEP503-HSVtk-EGFP能在HLEC中特异性表达，但HSV-tk在晶状体上皮细胞的表达效率明显低于CMV启动子。荧光显微镜观察20ug／mlGCV作用下的Lenti-LEP503-HSVtk-EGFP转染细胞，作用48小时后EGFP阳性细胞的形态发生明显变化。CCK-8试剂盒检测细胞的增殖抑制情况发现，GCV作用24h后Lenti-LEP503-HSVtk-EGFP转染细胞较正常HLEC组和Lenti-LEP503-HSVtk转染Hela细胞活性有明显抑制，且随时间的延长抑制效果逐渐增强。 第四部分全反式视黄酸(ATRA)对HSV—tk／GCV系统旁观者效应的增强作用研究 目的研究全反式视黄酸(ATRA)对HSV-tk／GCV系统在HLEC中旁观者效应的增强作用，并通过观察ATRA作用前后细胞中Connexin43的表达，探讨ATRA增强HSV-tk／GCV系统旁观者效应的机理。 方法通过CCK-8检测ATRA对晶体上皮细胞的毒性，得到无毒剂量ATRA。Western blot检测Connexin43的表达，CCK-8和DNA ladder检测ATRA对自杀基因旁观者效应的增强作用。 结果Western blot结果显示晶体上皮细胞自身表达的Connexin43较弱，随着作用时间(0、12、24、36、48小时)的延长表达逐渐增强。DNA ladder和CCK-8检测结果发现，ATRA能增强广谱启动子和特异性启动子的旁观者效应。 结论 1构建广谱启动子和晶体上皮细胞特异性启动子调控的慢病毒HSV-tk和EGFP共表达载体，使HSV-tk基因表达及对细胞的杀伤作用方便的通过荧光显微镜检测。 2慢病毒系统介导CMV-HSV-tk整合入HLEC的基因组并高效表达。当GCV浓度为10-25μg／ml时，GCV对转染细胞有明显的致凋亡或坏死作用，且随浓度的升高和时间的延长作用增强。HSV-tk／GCV系统还具有明显的旁观者效应。 3 LEP503启动子调控的HSV-tk能在HLEC中特异表达，并靶向性抑制HLEC增殖。但启动子表达效率较低，所介导的HSV-tk／GCV系统对HLEC的增殖抑制效果低于CMV调控的HSV-tk／GCV系统 4 10~(-7)mol／L ATRA可显著增强HSV-tk／GCV系统的旁观者效应，ATRA增强旁观者效应的作用机理可能与Cx43的表达的上调有关
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