基于生物信息学的小细胞食管癌基因表达谱及拷贝数变异研究  学位论文  

背景与目的：小细胞食管癌是一种高度恶性的食管原发肿瘤,由于其较为罕见,至今无法设计前瞻性临床研究,亦无治疗指南。基于小细胞食管癌与小细胞肺癌在生物学行为、病理组织形态、某些免疫组化指标方面一定程度的相似性,目前临床上参考小细胞肺癌对小细胞食管癌进行分期和治疗,但尚无分子生物学依据。即便是借鉴了小细胞肺癌的治疗模式,小细胞食管癌初治后极易复发转移,二线治疗疗效差,远期生存率未显著提高,总体疗效仍不理想。目前小细胞食管癌分子遗传学的研究几为空白,而参考小细胞肺癌治疗模式所获疗效是否已达最优尚不得而知,因此迫切需要深入了解其分子特征从而筛选有效的治疗靶点。本研究将借助人类全基因组芯片平台首次从基因表达谱和拷贝数变异的角度对小细胞食管癌及与其可能较为相关的肿瘤-小细胞肺癌、食管腺癌/鳞癌进行分析、比较,了解可能为潜在治疗靶标的肿瘤相关基因,以期为小细胞食管癌后续的基础和疗效研究提供依据或提示研究方向。材料与方法：复旦大学附属肿瘤医院组织库近期收集的三对小细胞食管癌及癌旁新鲜冰冻组织标本,经标准流程进行RNA及DNA抽提、纯化、质检后,采用Affymetrix Human U133 Plus 2.0 Array对小细胞食管癌转录水平基因表达模式进行分析,并从NCBI基因表达综合数据库中筛选同芯片平台、近3年的小细胞食管癌、食管腺癌、食管鳞癌及相应正常组织(GSE30219、GSE26886)的原始基因表达谱数据,与小细胞食管癌的表达谱数据进行比较。上述肿瘤与相应癌旁或正常组织分别归一化后,以错误发现率(False Discovery Rate, FDR)<0.01且倍数差异(Fold Change, FC)≥2为标准筛选差异表达基因(Differentially Expressed Genes, DEGs)。DEGs分别使用DAVID 67及GSEA 2.013进行注释,使用STRING 9.0进行网络分析。小细胞食管癌的基因拷贝数变异(copy number variations, CNVs)研究利用基于芯片的比较基因组杂交技术(array-based Comparative Genomic Hybridization, aCGH),芯片平台为Agilent Human aCGH 4×180k Array。使用CytoGenomics 2.7.8.0软件进行质控及CNVs筛选,2对及以上样本出现的CNVs定义为高频且研究范围仅限于常染色体。将至少1例小细胞食管癌的CNVs所涉及基因与表达谱研究中以FDR<0.01且FC≥2标准筛选所得的DEGs采用Refseq Transcript ID进行CNV和表达谱的关联,共同的基因使用DAVID6.7进行注释。为进一步研究CNV对基因mRNA表达的影响,本研究借鉴文献中的方法进行小细胞食管癌aCGH数据与表达谱数据的整合分析,计算高频区段基因的拷贝数相关基因表达倍数变化CNV-FC,使用SPSS19.0计算Log2(基因拷贝信号)Log2FC的Pearson相关系数r及相应p值,CNV-FC≥2且r≥0.6(p<0.05)的基因视为可能有意义的靶基因。最后,参考已发表文献进行小细胞食管癌与小细胞肺癌、食管鳞癌的CNVs及涉及基因的比较。结果：3对小细胞食管癌及相应癌旁组织提取RNA及DNA满足质控要求,基因表达谱及aCGH芯片实验质量良好。表达谱研究结果显示,与癌旁组织相比,小细胞食管癌筛选得1485个DEGs,神经内分泌相关基因及增殖指标高表达；WNT相关基因簇上调、PTEN、RB、NOTC H相关基因簇下调；DNA复制、细胞周期、有丝分裂、DNA修复、端粒维持等生物过程及P53等通路存在DEGs的显著富集。小细胞食管癌、小细胞肺癌、食管腺癌／鳞癌表达谱数据的整合分析发现,较之食管腺癌／鳞癌,小细胞食管癌与小细胞肺癌拥有更多相同的DEGs (829 vs.450),且相关系数更大(Pearso n相关系数：小细胞食管癌vs.小细胞肺癌为0.60,小细胞食管癌vs.食管鳞癌为0.51,小细胞食管癌vs.食管腺癌为0.45,食管腺癌vs.食管鳞癌为0.73)；小细胞食管癌在主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)的二维空间上与小细胞肺癌更加接近。对上述肿瘤的DEGs分别注释后发现,较之食管腺癌／鳞癌,小细胞食管癌与小细胞肺癌具有更多相同的生物学过程及信号通路,显著富集于细胞周期、有丝分裂、DNA复制、DNA修复、端粒酶维持、P53通路；食管腺癌与食管鳞癌这两种常见的食管肿瘤则生物学过程及通路高度相似,体现在ECM受体相互作用、轴突引导、整合素信号通路、组织发育、凋亡调控等方面。此外,小细胞食管癌与小细胞肺癌有更多共同上调的DEGs(584 vs.155),而与食管腺癌／鳞癌有稍多的共同下调DEGs(295 vs.245),且这些共同上调基因的注释结果与小细胞食管癌、小细胞肺癌所有DEGs分别注释后再取交集所得的注释结果高度一致。进一步的网络分析显示,小细胞食管癌与小细胞肺癌在转录层面形成的生物网络非常相似,均以基因NUF2为中心,相同的网络骨架基因有CENPF、NEK2、 KIF11、TMPO、FOXM1;小细胞食管癌的网络骨架基因主要参与细胞周期、有丝分裂、细胞周期检验点、纺锤体组装、微管结合、细胞骨架蛋白结合等生物学过程。3对小细胞食管癌及相应癌旁组织经CNVs分析得到高频区段13个,其中14q11.2在3例小细胞食管癌样本中均扩增,4q22.3-23在3例样本中均缺失。2例样本存在的扩增区段涉及5条染色体,分别是3q25.31-q29、5p15.31-15.2.8q21.11-24.3、9p23-13.1、14q11.2-32.33；2例样本存在的缺失区段涉及3条染色体,分别是3p26.3-25.3、4p16.3-11、4qll-22.3、4q23-25.8p23.3.16p13.3。结合小细胞食管癌的表达谱数据,找到CNV与mRNA表达同步变化的基因306个,扩增且上调基因194个,缺失且下调基因112个这306个基因的注释结果与单纯表达谱所得DEGs的注释结果具有较好的一致性,显著富集于DNA复制、细胞周期、有丝分裂、DNA修复等生物过程及P53、RB等通路。上述协同变化基因中包含表达谱研究中非常重要的网络调控基因NUF2、CCNE2、NFIB、 ETV5、KLF5、ATAD2、NDC80、ZWINT、本研究进一步得至CNV-FC≥2且r>0.6(p<0.05)的基因39个,这些基因的表达能够较好的区分小细胞食管癌与癌旁组织。上述39个基因的CNV-FC中位值为5.35(95% CI:4.53-16.98), PTP4A3基因的CNV-FC值最大,为21362.13, Pearson相关系数为0.9983(p=0.037)。由于目前尚未找到与本研究采用相同aCGH平台的小细胞肺癌及食管腺癌/鳞癌数据,故在无法进行芯片层面整合分析的前提下,我们收集既往文献中小细胞肺癌、食管鳞癌较公认的、高频的CNVs数据,与小细胞食管癌的aCGH数据进行比对,结果提示小细胞食管癌和小细胞肺癌结果提示小细胞食管癌和小细胞肺癌两者间具有更多的潜在肿瘤相关基因且频率较为接近,但是由历史对照这所得的这一结论尚需更多数据的支持和论证。结论：小细胞食管癌是一种遗传特征较为独特的食管恶性肿瘤,具有高度的复杂性和异质性。本研究涉及的aCGH数据与表达谱数据质量良好,两者具有较好的一致性。研究结果初步提示,和较为常见的食管腺癌／鳞癌相比,小细胞食管癌与小细胞肺癌可能在基因mRNA表达模式和CNV层面更加相似,有待系统、全面的研究数据支持。此外,细胞周期、有丝分裂、DNA复制、DNA修复等生物过程及P53、RB等通路可能在小细胞食管癌中扮演重要角色,NUF2、PTP4A3等基因可能是参与小细胞食管癌发生、发展、转移的潜在肿瘤相关基因,需要后续验证性研究。