海藻糖对未转染和已转染人野生型或A53T突变型α突触核蛋白基因的PC12细胞的促自噬作用研究  学位论文  

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是常见的神经退行性疾病，但迄今该病病因和发病机制未明。路易小体(Lewy body)是PD患者脑内特征性的病理学标志，异常聚集的α突触核蛋白(α-synuclein)是家族遗传性和散发性PD患者脑内路易小体的主要成份。α突触核蛋白的病理性积聚是PD临床症状发生、发展及受累脑区变性的重要原因。如何阻断α-synuclein的异常沉积或者促进聚集的α-synuclein降解是当前PD研究中的重要课题。近年来，相关研究发现海藻糖通过与蛋白质分子间的相互作用，可抑制中枢神经系统变性病中相关蛋白的异常聚集。海藻糖还可促进强力霉素诱导的转染人A53T突变型α-synuclein基因的PC12细胞自噬，并且能促使突变的α-synuclein降解。我们利用慢病毒表达载体，建立长期稳定过表达人野生型和A53T突变型α-synuclein的PC12细胞株，利用蛋白酶体抑制剂(MG132)抑制α-synuclein降解，建立α-synuclein异常聚集的PD细胞模型，观察海藻糖是否对未转染的PC12细胞、过表达人野生型和A53T突变型α-synuclein的PC12细胞有相似的促自噬作用，并且能否使异常聚集的野生型和A53T突变型α-synuclein降解；另外，自噬的增强对细胞的存活是否有影响。 第一部分人野生型和A53T突变型α-突触核蛋白慢病毒表达载体的构建及在PC12细胞中的转染 目的构建长期稳定过表达人野生型和A53T突变型α-突触核蛋白的PC12细胞株。材料和方法首先制备慢病毒表达载体，经测序鉴定正确后转染PC12细胞，然后通过细胞的免疫荧光染色检测α-synuclein-V5融合蛋白，PCR法扩增转基因PC12细胞的SNCA片段后进行测序检测突变基因，Western Blot法检测PC12细胞α-synuclein的表达从而鉴定转基因细胞能否稳定表达目的基因，MTT法测细胞活力，绘制生长曲线。结果经测序，pLenti6／V5-SNCA-WT和pLenti6／V5-SNCA-A53T表达质粒构建成功；免疫荧光染色示基因转染后，大于95％的PC12细胞中有α-synuclein-V5融合蛋白表达；转基因细胞的SNCA片段测序结果显示，慢病毒表达载体成功整合入PC12细胞基因组；Western Blot法检测结果示转基因PC12细胞能够过表达α-synuclein蛋白。3种细胞生长曲线无明显差异。结论我们已成功构建了人野生型和A53T突变型α-突触核蛋白慢病毒表达载体，并且成功建立了稳定过表达人野生型和A53T突变型α-突触核蛋白的PC12细胞株，过表达人野生型和A53T突变型α-突触核蛋白对细胞活力无明显影响。 第二部分海藻糖促进未转染和已转染人野生型或A53T突变型α突触核蛋白基因的PC12细胞自噬 目的研究海藻糖对未转染和已转染人野生型或A53T突变型α-synuclein基因的PC12细胞的促自噬作用。材料和方法用不同浓度(10mM、50mM和100mM)的海藻糖干预细胞24h，然后用免疫荧光检测自噬泡及自噬溶酶体，用透射电镜观察细胞内自噬泡数量的变化，用免疫印迹检测LC3II和α-synuclein的表达，观察海藻糖对细胞是否有促自噬作用，能否促进过表达的人野生型和A53T突变型α-synuclein降解；用MTT法检测细胞活力，观察海藻糖对细胞有无损伤或保护作用。结果50mM和100mM的海藻糖能使细胞内自噬泡和自噬溶酶体显著增多，并且使LC3II的表达量显著上调(P＜0.01)，同时促进A53T突变型α-synuclein的降解(50mM海藻糖组，P＜0.05；100mM海藻糖组，P＜0.01)，而对WT型α-synuclein无明显影响(P＞0.05)；给予2mM 3-MA预孵育3小时可以阻断海藻糖的促自噬作用；50mM和100mM海藻糖均能降低PC12细胞和A53T转基因细胞的活力(P＜0.01)，仅100mM海藻糖能降低WT转基因细胞活力(P＜0.05)。海藻糖对WT转基因细胞的损伤作用较其他两种细胞弱(P＜0.05)。结论海藻糖能促进未转染和已转染人野生型或A53T突变型α-synuclein基因的PC12细胞自噬，并且能促进A53T突变型α-synuclein降解，但对野生型α-synuclein无明显作用。大剂量海藻糖能降低细胞活力，对WT转基因细胞的活力影响较轻。 第三部分海藻糖对蛋白酶体抑制剂介导的PD细胞模型的作用 目的研究海藻糖对蛋白酶体抑制剂介导的α-synuclein异常聚集模型的促自噬作用。材料和方法给予500nM MG132、500nM MG132同时加不同浓度(10mM、50mM、100mM)海藻糖进行干预，继续培养24h后，进行免疫荧光检测细胞内的自噬泡、溶酶体和自噬溶酶体，用免疫印迹检测LC3II和α-synuclein的表达，观察海藻糖对MG132介导的细胞模型是否有促自噬作用，是否能促进异常聚集的人野生型和A53T突变型α-synuclein降解；用MTT法检测细胞活力，观察海藻糖对MG132介导的细胞损伤有无保护作用。结果500nM MG132能显著抑制α-synuclein降解(P＜0.05)，并且代偿型增多细胞内自噬泡、溶酶体和自噬溶酶体的数量，海藻糖能增强MG132介导的细胞自噬现象，使LC3II的表达量比500nM MG132单独作用时明显上调(P＜0.05)；海藻糖能促进细胞内异常聚集的A53T突变型α-synuclein降解(50mM海藻糖组，P＜0.05；100mM海藻糖组，P＜0.01)，但对野生型α-synuclein无明显作用；海藻糖能明显加重MG132介导的细胞损伤(P＜0.05)。结论蛋白酶体抑制剂MG132能导致细胞内α—synuclein异常聚集，同时增强细胞自噬。海藻糖可显著增强MG132介导的细胞自噬，并且能促进异常聚集的A53T突变型α-synuclein降解，但对野生型α-synuclein无明显作用。海藻糖加重MG132介导的细胞损伤。 结论 1．成功建立长期、稳定过表达人野生型和A53T突变型α—synuclein的PC12细胞系。 2．海藻糖增强细胞的自噬降解活性，但仅能降解A53T突变型α—synuclein蛋白，对野生型α—synuclein作用不明显。 3．在营养状况正常的情况下，大剂量海藻糖使细胞活力下降。 4．蛋白酶体抑制剂MG132能导致细胞α—synuclein异常聚集，同时增强细胞自噬，可能为细胞的代偿性反应。 5．海藻糖能显著增强蛋白酶体抑制剂MG132介导的细胞自噬。 6．海藻糖加重蛋白酶体抑制剂MG132介导的细胞损伤。