复合SDF-1α的组织工程血管支架在小口径人造血管移植和重建中的研究  学位论文  

血管移植是目前血管病治疗的一种普遍手术方法,由于自体血管移植存在种种缺陷,因此应用细胞或不应用细胞的组织工程血管支架在体外试验中被研制。但是这类方法制作的血管花费大量的时间,并不适用于紧急治疗的需要。而目前临床应用的人造血管由于易于急性血栓形成往往限于直径较大血管,且远期研究内皮化率较低,小口径人造血管易于血栓的高形成率目前尚无法适用临床治疗。具有生物活性的组织工程血管支架(TEVG)如果要用于血管移植对材料和其携带的生物活性物质的高组织相容性提出要求。在本研究中我们阐述了应用静电纺丝技术,同时采用高分子聚合材料PLLA/PCL,一步法制作的具有生物活性、人工合成、可降解、高组织相容性并具有细胞外基质特性的小口径组织工程血管支架,同时将这一新型血管支架移植于动物体内,并通过体内外实验研究其在原位血管重建的功能,同时发现这类新型血管支架在重建过程中具有同时吸引两种干细胞的功能。 第一部分静电纺丝PLLA/PCL小口径血管支架的制作和特性研究 目的：应用静电纺丝技术选折合适材料制作具有生物力学特性的组织工程血管支架。 方法：使用高分子可降解材料左旋聚乳酸/聚己酸内酯以19%/5%的质量比例浓度混合物和单纯左旋聚乳酸分别溶解于六氟异丙醇,应用静电纺丝技术电纺于直径为1mm的圆柱形棒状接收屏,制成组织工程血管支架,在扫描电镜分析纺丝直径并测试其机械力学特性。 结果：1.浓度为19%PLLA/5%PCL溶液静电纺所得的纤维平均直径982.3nm符合纳米材料的直径要求。2.静电纺所得组织工程血管支架平均内径1.000mm±0.013mm,平均外径1.302mm±0.021mm,平均厚度150.1μm±10.5μm。3.19%PLLA/5%PCL支架平均杨氏模量为5.19±0.7Mpa,19%PLLA和自体血管分别为12.85±0.11Mpa、9.66±0.13Mpa,具有显著差异P<0.05。 结论：采用静电纺丝技术制备的组织工程小口径血管支架的纤维宽度及空隙达到纳米材料级别。PLLA/PCL的抗拉性和延展性明显优于单纯PLLA和自体血管,是较为理想的生物材料。PLLA/PCL支架的最大受力显著优于单纯PLLA材料,但较自体血管小。 第二部分肝素-SDF-1α交联的组织工程血管支架的药物释放及移植后物理特性研究 目的：应用共价键化合特性将肝素交联与血管支架上,基于肝素可与SDF-1α静电电荷作用原理交联SDF-1α于血管支架上,并检测其稳定性。使用采用血管内直径为1mm TEVG,应用端端吻合技术植入SD大鼠的颈总动脉内,研究其血管通常率和生物组织力学改特性的变。 方法：使用0.01N NaOH处理支架表面以增加羧基密度后应用碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺供价连接与羧基,使用聚乙二醇二胺作为肝素连接分子将肝素交联于TEVG,用甲苯胺蓝染色法测定肝素的释放。SDF-1α与肝素相互作用后与肝素交联,通过酶联免疫吸附测定测定SDF-1α的释放。免疫组化观察不同浓度的SDF-1α交联后的染色强度。应用端端吻合技术吻合TEVG于SD大鼠左颈总动脉之上,多普勒超声验证各时间点血管通畅程度,各时间点取出支架后测试机械力学特性。 结果：通过甲苯胺蓝试剂法测定,平均每个PLLA/PCL支架肝素含量浓度为15.31±2.31μg/mm3。通过夹心法酶联免疫吸附试验测定,以500ng/mlSDF-1α起始交联浓度,平均每个PLLA/PCL支架SDF-1α含量浓度为140.5±4.1nng/mm3。SDF-1α交联的起始溶液浓度和支架SDF-1α的结合浓度呈等比关系。手术结束即刻通畅率为100%,肝素-SDF-1α组在除在第一周通畅率与肝素组接近外(88.9%),其余各个时间点肝素-SDF-1α组的通畅率最高P<0.05,肝素组的通畅率也高于空白对照组P<0.05。肝素-SDF-1α组支架在4周后的机械强度与自体血管较为接近,达到了组织工程血管支架的力学要求,各时间点肝素-SDF-1α生物力学特性明显优于其他两组(P<0.05)。 结论：19%PLLA/5%PCL二元共混静电纺丝,具有良好的肝素交联性能。肝素化PLLA/PCL支架可高效结合SDF-1α,制备有效的具有生物活性TEVG, SDF-1α起始交联浓度可定为500ng/m1。肝素-SDF-1α组的TEVG近期及远期通畅率均明显高于肝素组和空白对照组。肝素-SDF-1α组的TEVG在4周内其弹性强度(弹性模量)接近并超过了自体血管的强度,肝素组和空白对照组在12周后弹性模量也接近了自体血管,19%PLLA/5%PCL的TEVG在植入体内后其生物力学特性可接近自然血管。 第三部分血管支架内表面内皮化功能的研究 目的：通过体内、体外实验研究生物活性组织工程血管支架内皮化效率和机制。 方法：1.体外试验：体外培养牛内皮细胞,M199培养液中加入不同浓度的SDF-la溶液,研究不同浓度SDF-1α对内皮细胞迁移能力的影响。2.取出不同时间点的TEVG,应用免疫组化方法分析TEVG内表面的内皮化率和内皮化机制。 结果：对照组、肝素组15μg/ml、SDF-1α组浓度分别为20ng/ml、50ng/ml、150ng/ml时,ECs细胞迁移数分别为3.5±0.58个,7.9±1.09个,18.3±1.73个,24.7±2.05个,31.1±2.46个,具有显著差异P<0.05。1周的SDF-1α组TEVG内表面吸引更多的细胞(1570±413mm2,n=3),具有显著差异性P<0.05,且可以观察到大量CD34+/CD133+/CD31-的EPCs聚集于内表面。4周的SDF-1α组内皮化率高于其他两组,CD34/CD133表达下调,内皮细胞成熟。 结论：1.体外试验SDF-1α可有效吸引内皮细胞的迁移,证明SDF-1α可诱导血管内皮细胞迁移。2.肝素-SDF-1α交联组的组织工程血管(TEVG)可有效的全程吸引内皮祖细胞(EPCs),在4周内即有效全程内皮化。 第四部分血管支架外表面的研究 目的：通过体内、体外实验研究生物活性组织工程血管支架对平滑肌祖细胞的吸引能力和平滑肌细胞分化成熟的能力研究。 方法：1.体外试验：手术取出各组种植3天TEVG体外细胞培养并鉴定细胞,并用Real-time PCR的检测各时间点平滑肌细胞特异标记物α-SMA、CNN1对应的基因表达。2.体内实验：免疫荧光法检测各个时间点各组外周组织的α-SMA、 MHC、CNN1、Sox10、Sox17表达,计算阳性细胞率,Verhoeff s弹力蛋白染色检测第4周时TEVG外周组织弹力蛋白和胶原蛋白的表达。 结果：1.体外试验：细胞培养发现除肝素-SDF-1α组外,肝素组和对照并无α-SMA阳性表达细胞生长。1周细胞仅表达α-SMA,而CNN1和MHC均为阴性表达,4周细胞表达α-SMA同时CNN1和MHC表达大幅增高,Real-time PCR的结果显示随着时间推移细胞的α-SMA和CNN1的mRNA的表达逐渐增加,统计分析具有显著差异P<0.01。2.体外试验：1周TEVG外层组织SDF-1α组α-SMA的阳性细胞率为87.2±5.1%(n=3),明显高于肝素组64.2±4.2%(n=3)和对照组46.2±3.7%(n=3),统计有显著差异P<0.05,4周时肝素-SDF-1α组CNNl和MHC的阳性细胞率为89.7±4.9%(n=5)高于肝素组72.3±3.4%(n=4)和对照组31.2±2.7%(n=3),统计有显著差异P<0.05。4周外层组织双染COL1/MHC,分析两种蛋白表达我们发现肝素-SDF-1α组的COL1密度明显高于对照组和肝素组,Verhoeff's弹力蛋白染色表面肝素-SDF-1α组弹性蛋白和胶原明显高于其他组。 结论：1.通过体外实验发现一种Sox10+/Sox17+/CD34-的具有平滑肌祖细胞特性的干细胞。2.体内外实验证实肝素-SDF-1α交联的TEVG具有强大的平滑肌祖细胞吸引功能,并刺激平滑肌祖细胞向平滑肌细胞方向分化、增殖,表达相关蛋白产物。