抗肿瘤烷化剂卡莫司汀(1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea, BCNU)是临床上治疗脑胶质瘤最常使用的化疗药物之一,但其临床应用中容易产生耐药性,这与肿瘤细胞中O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA-methyltrans-ferase, MGMT)的修复作用有关,06-苄基鸟嘌呤(O6-benzylguanine,BG)能直接消耗细胞中的MGMT逆转其耐药性。本课题组前期研究中采用乳化溶剂挥发法制备了PLGA/CS双层载药纳米粒,内外层分别包载BCNU和BG两种药物,与BCNU原药相比,显著延长了药物的体内滞留时间,提高了跨血脑屏障(blood brain barrier, BBB)能力,增强了BCNU的抗肿瘤活性,但此纳米粒递药系统中BG和BCNU先后释药行为不理想,靶向递药能力有待进一步提高。许多肿瘤细胞(包括脑胶质瘤细胞)以及其新生血管内皮细胞表面都会高度表达αv整合素,一种名为“内化RGD(internalizing RGD, iRGD, CCRGDK/RGPDC)的环状多肽,不仅与整合素具有较高的亲和力,而且能够通过肿瘤部位蛋白水解酶的作用,水解产生C端为RGDK/R序列的多肽片段,该多肽片段能进一步通过1-型跨膜糖蛋白(neuropilin-1, NRP-1)内化进入肿瘤细胞。本课题拟制备一种iRGD修饰的主动靶向双层纳米粒递药系统,改进PLGA/CS双层载药纳米粒的制备方法,并将目标多肽连接在纳米粒表面,以期达到较高的抗肿瘤活性,并做更进一步考察。课题在已建立的BCNU口BG分析方法基础上,考察两种药物在不同条件下的稳定性,同时对BCNU的细胞毒性以及BG对原药的增敏作用进行了考察。结果显示,温度和pH对BCNU的稳定性均有较大影响,在一定范围内降低温度和pH能提高其稳定性。细胞毒性实验显示,BG对C6、F98、U87三种肿瘤细胞均能起到显著的增敏作用,程度与细胞中MGMT的表达水平有关。本研究改用乳化溶剂分散法(spontaneous emulsification solvent diffusion method, SESD)制备共载BCNU和BG的PLGA/CS纳米粒,首先以粒径、Zeta电位和BCNU的载药量为指标对PLGA分子量、PLGA浓度、PVA浓度和CS浓度等进行单因素考察,进而通过正交试验获得最优处方。然后对纳米粒中BCNU的稳定性和体外释放行为进行考察,并与本课题组掌握的乳化溶剂挥发法(emulsion-solvent evaporation method, ESEM)制备的纳米粒相比较。结果显示,最优处方制得纳米粒粒径为121.6±3.3 nm, Zeta电位为32.3+4.1 mV,BCNU和BG的载药量分别为1.86+0.17%和6.82±1.15%,与原处方接近。体外稳定性研究显示,原纳米粒与本纳米粒表观一级降解动力学常数k的比值为1：8,本纳米粒显著提高了BCNU的稳定性。体外释放实验显示,4h时BG的释放量已接近100%,而BCNU 24 h时的累积释放量未超过65%,说明BG能够先于BCNU释放,BCNU有良好的缓释效果,达到预期目标。本研究采用双功能基团聚乙二醇(Maleimide-polyethyleneglycol-N-Hydroxysuccinimide, MAL-PEG-NHS, MW 2000)为间隙基将iRGD修饰在纳米粒表面。即先将PEG与CS共价连接,同法制备PLGA/CS-PEG纳米粒(PEG-NPs),然后通过iRGD与PEG一端的马来酰亚胺反应与纳米粒连接制得iRGD-PEG-NPs。 BCA显色反应和X射线光电子能谱(XPS)分析均证明多肽成功连接在了纳米粒表面。对纳米粒进一步表征结果显示,PEG-NPs的粒径、Zeta电位和载药量分别为1225±2.89nm、32.7±6.66 mV和1.82±0.11%,与 PLGA/CSNPs基本相同；而iRGD-PEG-NPs的粒径、Zeta电位和载药量分别为126.3±3.67nm,34.3±5.51 mV和 1.50±0.04%,载药量略低。电镜结果显示,制得纳米粒形态圆整,大小均一,具有核-壳型结构。分别对纳米粒中BCNU在pH 7.4 PBS和血浆中的稳定性进行考察,BCNU、PEG-NPs和iRGD-PEG-NPs中BCNU在pH7.4缓冲液中表观一级降解动力学常数k的比值为13.46：1：1.04,血浆中表观一级降解动力学常数k的比值为18.39：1：1.13,表明纳米粒在PBS和血浆中均能显著提高BCNU的稳定性。纳米粒的体外释放实验显示,PLGA/CS NPs、PEG-NP s和iRGD-PEG-NPs中BG在4h时的释放量均接近100%,而BCNU在24 h时的累积释放量均未超过68%,释放行为基本相同。以C6、F98和U87细胞为肿瘤细胞模型,采用MTT法考察载药纳米粒的细胞毒性。细胞毒实验显示,与原药相比,载药纳米粒的细胞毒性均显著高于原药组,联合应用BG后对三种细胞的毒性分别提高了2.3、4.0和1.7倍左右,显示了不同程度的增敏作用,iRGD多肽的修饰进一步提高了细胞毒性。采用倒置荧光显微镜和流式细胞仪分别对纳米粒的摄取行为进行了定性和定量考察。结果显示,细胞摄取量随纳米粒浓度的增大而增大,连接多肽能显著提高纳米粒向肿瘤细胞的内化摄取能力。进一步,以肿瘤球为模型体外考察纳米粒渗透肿瘤的能力,结果显示,多肽修饰纳米粒的渗透肿瘤的能力显著优于普通纳米粒。本课题构建了iRGD修饰的共载BCNU和BG两种药物的核-壳型纳米粒。BG能够先于BCNU释放,BCNU具有良好的缓释效果,纳米粒显著提高了BCNU的稳定性和体外抗肿瘤能力,增强了药物的肿瘤细胞摄取能力和渗透肿瘤能力。本研究提示iRGD修饰的纳米粒具有提高靶向能力、改善渗透肿瘤能力、增强抗肿瘤效果的潜力。
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