第一部分诺氏梭菌孢子(C. novyi-NT)在体外对人肝癌细胞HuH-7细胞系的毒性作用及对血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响 目的：研究在体外厌氧条件下,诺氏梭菌孢子(C. novyi-NT)对体外培养的人肝癌细胞HuH-7细胞系的毒性作用及其对VEGF表达与分泌的影响。 材料与方法：采用细胞培养技术,以人肝癌细胞HuH-7细胞系为靶细胞,将HuH-7细胞随机分成对照组、梭菌孢子组及阿霉素组,厌氧培养条件下分别加入磷酸盐缓冲液(PBS液)、诺氏梭菌孢子C. novyi-NT及阿霉素。处理12小时、24小时、48小时及72小时后,应用WST-1比色法测定各不同处理方法对人肝癌细胞HuH-7细胞系的毒性(0D值)。应用酶联免疫吸附试验(ELISA法)测定反应24小时、48小时及72小时后对照组及梭菌孢子组细胞培养基上清液中血管内皮生长因子(VEGF)蛋白含量。应用反转录聚合酶链反应法(RT-PCR法)分析厌氧培养72小时后对照组及梭菌孢子组HuH-7细胞的VEGF mRNA表达水平。 结果：将梭菌孢子C. novyi-NT加入体外培养的人肝癌细胞HuH-7细胞后显示出毒性作用和对该细胞系的生长抑制效应。加入梭菌孢子C. novyi-NT作用12小时后,细胞生长开始出现停滞,细胞呈圆形或球形,胞浆中出现颗粒状物质。72小时后,细胞培养基中出现更多细胞碎片。厌氧培养条件下,细胞损伤随时间的延长逐渐加剧。24小时后,梭菌孢子C. novyi-NT的细胞毒性作用明显强于对照组,两组0D值具有显著差异,与阿霉素组相比无明显差异。24、48、72小时细胞上清液中VEGF的量,梭菌孢子组与对照组相比无明显统计学差异；但72小时后,梭菌孢子组厌氧培养的细胞VEGF mRNA表达水平明显高于对照组(p=0.012)。 结论：在厌氧培养条件下诺氏梭菌孢子(C. novyi-NT)对体外培养的人肝癌细胞HuH-7细胞系有明显的细胞毒性作用,且影响VEGF的mRNA表达。 第二部分诺氏梭菌孢子(C. novyi-NT)联合化疗治疗裸鼠皮下移植肝癌的实验研究 目的：探索诺氏梭菌孢子(C. novyi-NT)联合化疗治疗裸鼠皮下HuH-7肝细胞肝癌的疗效及可能机制。 材料和方法：建立54只裸鼠皮下HuH-7肝细胞肝癌动物模型,7周后随机分为四组。空白对照组(n=13),腹腔注射磷酸盐缓冲液(PBS液)0.1ml；单纯梭菌孢子组(n=14),腹腔注射梭菌孢子悬液(浓度1×105个/m1)；阿霉素治疗组(n=12),1、3、5天腹腔注射阿霉素(浓度0.25mg/ml,1mg/kg)；阿霉素联合梭菌孢子治疗组(n=15),1、3、5天腹腔注射阿霉素(浓度0.25mg/ml,lmg/kg),第8天腹腔注射梭菌孢子悬液(浓度1×105个/ml)。每天测量裸鼠体重、皮下瘤体积大小、记录其自然死亡时间。待自然死亡后行病理免疫组化测定血管内皮生长因子(VEGF)、乏氧诱导因子-1(HIF-1)及微血管密度(MVD)的变化。肿瘤及重要脏器组织匀浆涂板,检测是否存在梭菌生长。 结果：54只裸鼠皮下瘤全部建模成功。处理后,对照组与单纯孢子组裸鼠皮下瘤持续生长,而阿霉素组及阿霉素孢子组肿瘤生长明显受到抑制,肿瘤体积缩小。经两两比较后发现对照组与单纯孢子组之间肿瘤相对体积无统计学差异,同阿霉素组或阿霉素孢子组相比具有统计学差异,阿霉素组与阿霉素孢子组肿瘤相对体积也有统计学差异。各处理组荷瘤裸鼠体重均逐渐下降,但阿霉素孢子组裸鼠在加用梭菌孢子后体重下降较其他三组明显变缓。阿霉素组及阿霉素孢子组荷瘤裸鼠生存期明显较对照组及单纯孢子组生存期长,且阿霉素联合孢子组与阿霉素组比较亦有统计学差异。经阿霉素处理后,VEGF表达明显增强、MVD明显增加,加用梭菌孢子处理后表达减弱,单独应用梭菌孢子未见VEGF表达明显减弱及MVD降低；各处理组之间HIF-1的表达无明显差异。尸检各脏器均未发现脓肿形成。处死后裸鼠皮下瘤及肝转移瘤组织匀浆涂板见梭菌菌落形成,其他各重要器官未见明显梭菌菌落形成。 结论：诺氏梭菌孢子联合化疗可有效抑制裸鼠皮下移植HuH-7肝细胞肝癌生长,延长荷瘤裸鼠生存期,体重下降变缓。厌氧菌诺氏梭菌孢子联合化疗能够减低局部MVD及VEGF勺表达。 第三部分诺氏梭菌孢子(C. novyi-NT)联合化疗对裸鼠皮下肝癌移植瘤肝转移的影响 目的：探讨诺氏梭菌孢子(C. novyi-NT)联合阿霉素治疗裸鼠皮下HuH-7肝细胞肝癌移植瘤产生的肝转移的影响。 材料与方法：建立62只裸鼠皮下HuH-7肝细胞肝癌动物模型,7周后随机分为四组。对照组(n=15),腹腔注射磷酸盐缓冲液(PBS液)0.1ml；单纯梭菌孢子组(n=16),腹腔注射梭菌孢子悬液(浓度1×105个/m1)；阿霉素治疗组(n=14),1、3、5天腹腔注射阿霉素(浓度0.25mg/ml,lmg/kg)；阿霉素联合梭菌孢子治疗组(n=17),1、3、5天腹腔注射阿霉素(浓度0.25mg/ml,1mg/kg),第8天腹腔注射梭菌孢子悬液(浓度1×105个/ml)。治疗前,每组处死2只裸鼠,检查肝脏是否发生转移。治疗后待其自然死亡,进行尸检确定每组发生肝转移裸鼠个数。裸鼠死亡后,皮下移植瘤、肝转移瘤及其他重要脏器组织匀浆涂板,检测是否存在细菌生长。 结果：治疗前,各组处死的裸鼠均未发生肝转移。治疗后,对照组、单纯孢子组、阿霉素组、阿霉素孢子组发生肝转移裸鼠个数分别为11只、11只、9只、8只,转移发生率分别为84.62%、78.57%、75%、53.3%。裸鼠死亡后,皮下移植瘤及肝转移瘤组织匀浆涂板见明显梭菌菌落生长。 结论：诺氏梭菌孢子能够在裸鼠皮下肝癌移植瘤造成的肝转移灶内选择性定植,阿霉素联合诺氏梭菌孢子可能能够有效抑制裸鼠皮下肝癌移植瘤造成的肝转移。
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