铁负荷状态对骨髓增生异常综合征转白细胞株SKM-1甲基化状态的影响  学位论文  

第一部分DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨对SKM-1细胞P15-基因甲基化状态的影响 目的：研究DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨(DAC)对骨髓增生异常综合征(MDS)转白血病细胞株SKM-1P15INK4B基因甲基化状态的影响。 方法：DAC处理组分为3组,分别以1.5μmol/L、3.0μmol/L和6.0μmol/LDAC处理SKM-1细胞48h,以未加DAC的SKM-1细胞培养48h作为对照组。甲基化特异性PCR (MSP)检测各组细胞P15INK4B基因甲基化情况,Realtime RT-PCR相对定量法检测P15INK4B基因mRNA表达情况,羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)法检测细胞增殖抑制情况,碘化丙啶(PI)单染法检测细胞周期,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞早期凋亡情况。 结果：(1)对照组SKM-1细胞的P15INK4B基因完全甲基化,未出现非甲基化条带,在1.5μmol/L、3.0μmol/L和6.0μmol/LDAC处理组,P15INK4B基因甲基化条带逐渐变浅,非甲基化条带出现并逐步加深；(2)对照组、1.5μmol/L、3.0μmol/L和6.0μmol/L组的P15INK4B基因mRNA表达水平分别为1.00±0.12、0.91±0.13、0.51±0.06和0.43±0.04,与对照组相比,3.0μmol/L组和6.0μmol/L组差异有统计学意义(P<0.05)；DAC处理组两两比较,3.0μmol/L组和6.0μmol/L组与1.5μmol/L组相比,差异有统计学意义(P<0.05);6.0μmol/L组与3.0μmol/L组相比,差异无统计学意义(P>0.05)；(3)对照组、1.5μmol/L、3.0μmol/L和6.0μmol/L组的CFSE平均荧光强度(MFI)分别为51.67±1.61、55.33±2.28、56.33±2.50和55.71±2.87,与对照组相比,3.0μmol/L组差异有统计学意义(P<0.05),1.5μmol/L组和6.0μmol/L组无统计学差异(P>0.05)；DAC处理组两两比较,差异均无统计学差异(P>0.05)；(4)对照组、1.5μ mol/L、3.0μmol/L和6.0μmol/L组的G1期细胞比例分别为55.78±3.61%、48.12±2.93%、51.69±1.60%和46.71±1.54%,S期细胞比例分别为44.22±3.61%、51.88±2.93%、48.31±1.60%和53.29±1.54%,与对照组相比,1.5μmol/L组和6.0μmol/L组差异有统计学意义(P<0.05),3.0μmol/L组差异无统计学意义(P>0.05)；DAC处理组两两比较,6.0μmol/L组与3.0μmol/L组相比,差异有统计学意义(P<0.05),其余差异无统计学意义(P>0.05)；(5)对照组、1.5μmol/L、3.0μmol/L和6.0μmol/L组的早期凋亡率分别为2.91±0.26%、7.77±0.22%、12.45±0.28%和13.86±0.27%,与对照组相比,DAC处理组差异均有统计学意义(P<0.05)；DAC处理组两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。 结论：DAC能逆转SKM-1细胞的P15IINK4B基因完全甲基化状态,在一定程度上抑制SKM-1细胞的增殖,使细胞分化阻滞在S期,并促进细胞凋亡；尚未发现DAC逆转P15INK4B基因甲基化状态的同时使沉默的P15INK4B基因mRNA重新表达。 第二部分 铁螯合剂去铁胺对SKM-1细胞P15INK4B基因甲基化状态的影响 目的：研究铁螯合剂去铁胺(DFO)对SKM-1细胞P15INK4B基因甲基化状态的影响。 方法：以枸橼酸铁铵(FAC)和DFO处理SKM-1细胞,按不同铁负荷分成3组：对照组、FAC组和FAC+DFO组,分别检测不同铁负荷组SKM-1细胞内可变铁池(LIP)、细胞内活性氧(ROS)、P15INK4B基因甲基化状态、P15INK4B基因mRNA表达情况、细胞增殖抑制情况、细胞周期以及细胞早期凋亡情况。 结果：对照组SKM-1细胞的P15INK4B基因完全甲基化,未出现非甲基化条带；FAC组SKM-1细胞的P15INK4B基因完全甲基化,也未出现非甲基化条带；FAC+DFO组SKM-1细胞的P15INK4B基因甲基化条带变浅,并出现非甲基化条带；与对照组相比,FAC组的LIP(64.04±2.12vs1.45±0.65)％.ROS(45.57±1.18vs33.38±12.96)％明显升高,CFSE的MFI(23.01±5.20vs51.67±1.61)%、P15INK4B基因mRNA表达(0.72±0.08vs1)和细胞早期凋亡率(1.76±0.11vs2.91±0.25)%明显减少,差异均有统计学意义(P<0.05)；与FAC组相比,FAC+DFO组的LIP(8.34±4.21vs64.04±2.12)%、ROS(34.39±2.12vs45.57±1.18)%明显减少,CFSE的MFI(37.34±6.61vs23.01±5.20)%、P15INK4B基因mRNA表达(1.50±0.15vs0.72±0.08)和细胞早期凋亡率(4.77±0.88vs1.76±0.11)%明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)；3组细胞的细胞周期差异无统计学意义。 结论：铁螯合剂DFO可使铁过载的SKM-1细胞LIP和ROS降低,诱导铁过载的SKM-1细胞P15INK4B基因去甲基化,使其mRNA重新表达,并可抑制铁过载的SKM-1细胞增殖,促进其早期凋亡。 第三部分 地西他滨联合去铁胺对SKM-1细胞P15INK4B基因甲基化状态的影响 目的：研究DAC联合DFO对SKM-1细胞P15INK4B基因甲基化状态的影响。 方法：以FAC、DFO和DAC处理SKM-1细胞,分成4组：对照组、FAC组、FAC+DFO组和FAC+DFO+DAC组,分别检测不同处理组SKM-1细胞内ROS、P15INK4B基因甲基化状态、P15INK4B基因mRNA表达情况、细胞增殖抑制情况、细胞周期以及细胞早期凋亡情况。 结果：(1)对照组、FAC组、FAC+DFO组和FAC+DFO+DAC组ROS的MFI分别为33.38±12.96、45.57±1.18、34.39±2.12和36.64±1.96,与FAC组相比,FAC+DFO组和FAC+DFO+DAC组的ROS明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)；(2)MSP检测,对照组和FAC组仅出现M条带,FAC+DFO组和FAC+DFO+DAC组M条带变浅,并出现U条带,P15INK4B基因呈完全甲基化状态得到一定程度逆转。(3)对照组、FAC组、FAC+DFO组和FAC+DFO+DAC组SKM-1细胞的P15INK4B基因mRNA相对表达水平分别为1.00±0.12、0.71±0.08、1.49±0.15和1.31±0.13,与FAC组相比,FAC+DFO组和FAC+DFO+DAC组的P15INK4B基因mRNA相对表达水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)；(4)对照组、FAC组、FAC+DFO组和FAC+DFO+DAC组SKM-1细胞CFSE的MFI分别为51.67±1.61、23.01±5.20、37.34±6.61和39.61±6.92,与FAC组相比,FAC+DFO组和FAC+DFO+DAC组CFSE的MFI增高,差异有统计学意义(P<0.05)；(5)对照组、FAC组、FAC+DFO组和FAC+DFO+DAC组SKM-1细胞G1期比例分别为55.78±3.61%、50.2±9.20%、51.10±6.30%和49.58±3.38%,S期比例分别为44.22±3.61%、49.77±9.20%、48.90±6.30%和50.42±3.38%,与FAC组相比,FAC+DFO组和FAC+DFO+DAC组Gl期细胞比例有下降,S期细胞比例有升高,但差异无统计学意义(P>0.05)；(6)对照组、FAC组、FAC+DFO组和FAC+DFO+DAC组SKM-1细胞的早期凋亡率分别为2.91±0.25%、1.76±0.11%、4.77±0.88%和8.94±0.87%,与FAC组和FAC+DFO组相比,FAC+DFO+DAC组SKM-1细胞的早期凋亡率均明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。TUNEL染色荧光显微镜观察显示FAC+DFO+DAC组早期凋亡细胞增加。结论：与单用DFO干预铁过载的SKM-1细胞相比,联用DFO和DAC双重干预,P15INK4B基因甲基化状态和mRNA表达水平未发现明显变化,但可诱导细胞早期凋亡增加,对细胞增殖与细胞周期无明显影响。