哺乳动物耳蜗毛细胞再生能力非常有限,通过基因或药物的干预可能促使一定程度的修复。对转基因小鼠进行实验研究发现细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂(CDKI) p27以及视网膜母细胞瘤(Rb)蛋白是哺乳动物支持细胞重新进入细胞周期的重要调节因素。为了让毛细胞在损伤后得以修复,这些蛋白可能成为短暂性基因敲减的靶标。此外,通过逆转录病毒介导Atohl转录因子能够使部分成熟支持细胞转分化为毛细胞。但是,异位再生毛细胞在其发育过程中是否也发生发育过程中的平面细胞极性(PCP)改变备受关注。 ADF/destrin是肌动蛋白解聚因子家族中的一员,其它成员还包括cofilinl (n-cofilin)以及cofilin2。研究表明该家族成员可结合丝状肌动蛋白增加肌动蛋白解聚的效率,加速肌动蛋白更新周转,从而影响细胞骨架的重塑和细胞的主动运动,同时n-cofilin在果蝇的同类物tsr经研究证实为果蝇翅毛PCP过程以及光感受器汇聚伸展过程所需要。已有研究对小鼠耳蜗、前庭椭圆囊、球囊以及螺旋神经元在发育过程ADF/destrin的分布做了详细分析。但目前尚未有ADF/destrin在内耳半规管壶腹感觉上皮的发育分布报道以及ADF/destrin与过表达Atohl诱导再生毛细胞之间的相关研究,有关再生毛细胞纤毛极性发育以及PCP相关蛋白对该发育过程的功能影响也研究甚少。 本研究中,我们主要通过免疫荧光染色和激光共聚焦显微镜观察的方法比较了正常发育阶段从胚胎期第14.5天(E14.5)到出生后4天(P4)小鼠内耳耳蜗听觉上皮、前庭椭圆囊感觉上皮、半规管壶腹感觉上皮中ADF/destrin的定位分布以及体外离体培养耳蜗基底膜经转染腺病毒过表达Atohl诱导的大上皮嵴异位再生毛细胞在培养第6天和第12天ADF/destrin以及极性相关蛋白γ-tubulin的表达定位变化。结果显示在内耳耳蜗听觉上皮中ADF/destrin在胚胎期14.5天(E14.5)主要分布于小部分毛细胞和支持细胞表皮板边缘,胚胎期18.5天(E18.5)和出生后1天(P1)主要分布于毛细胞表皮板和支持细胞表皮板及胞体,出生后4天(P4)只存在于支持细胞,毛细胞内不表达；在内耳前庭椭圆囊感觉上皮中ADF/destrin在E14.5主要存在支持细胞胞体及部分表皮板边缘,毛细胞不表达,E18.5时分布于支持细胞胞体以及部分毛细胞动纤毛上,P1时主要分布于毛细胞及其动纤毛上,支持细胞不表达,出生后4天(P4)则只分布于支持细胞；在内耳水平半规管壶腹感觉上皮中ADF/destrin在E14.5主要分布在支持细胞表皮板边缘以及少量微绒毛上,E18.5时主要分布于支持细胞胞体,毛细胞不表达,P1时仍然主要分布于支持细胞中,但壶腹嵴外侧毛细胞及其动纤毛开始表达ADF/destrin。随后我们通过体外培养刚出生2-3天小鼠耳蜗基底膜并转染腺病毒过表达Atohl诱导大、小上皮嵴产生异位再生毛细胞,培养第6天时ADF/destrin在部分Myo7a(+)细胞中有表达,培养第12天时ADF/destrin在Myo7a(+)细胞中几乎没有分布,而是存在于非Myo7a(+)细胞中。异位再生Myo7a(+)细胞在离体培养过程中ADF/destrin的分布变化与正常发育的耳蜗听觉上皮毛细胞在胚胎期(E14.5-E18.5)表达而出生后(P1-P4)不表达destrin的现象一致。 PCP信号通路被证实在哺乳动物内耳发育过程中发挥着重要作用,它指导内耳感觉上皮汇聚伸展并形成方向统一的阶梯状静纤毛束,而肌动蛋白重塑密切参与了细胞极化和PCP核心蛋白的重分布机制。我们研究结果发现过表达Atohl诱导的异位再生毛细胞在培养不同时间其基体位置发生迁移,在过表达Atohl早期(转染腺病毒后培养1周以内),γ-tubulin所标记的纤毛基体出现在单个异位再生Myo7a(+)细胞的中部,培养1周之后单个异位再生Myo7a (+)细胞基体移至细胞边缘。 此外,本研究还发现,刚出生小鼠耳蜗基底膜离体培养条件下,Testosterone-BSA处理组小上皮嵴细胞(lesser epithelial ridge, LER)的BrdU阳性率相比正常对照组显著增加,提示Testosterone-BSA对刚出生小鼠耳蜗基底膜LER细胞增殖的影响。
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