乙肝病毒是世界范围内最常见的病原体之一。在我国约有 1.3-1.5 亿乙肝病毒携带者,其中一半左右为母婴宫内或围产期传播。乙肝病毒宫内感染者中约 90%慢性化,并维持长时间的免疫耐受状态,对药物应答率低,是肝硬化、肝功能失代偿和肝细胞肝癌的高危因素。因此,乙肝病毒宫内感染的阻断是一项重要的课题。 我们采用乙肝疫苗联合高效价免疫球蛋白母婴联合阻断的方式,仍有5%-10%的高危儿童未能得到有效保护,这部分儿童是我们乙肝病毒母婴传播阻断研究中的主要课题。 乙肝病毒宫内感染免疫耐受主要在 T 细胞水平。胎儿宫内感染的病毒颗粒或通过胎盘传递的病毒抗原造成 MHCⅡ类限制的乙肝病毒特异性 T 细胞在胸腺中缺如可能是其主要原因。 随着基因组医学研究的不断深入,不同的遗传背景对人类疾病在易感性、疗效和转归等方面产生的影响已得到越来越多的证实。单核苷酸多态性是人类DNA 变异中最常见的形式,约占其 90%,被认为是最有价值的遗传标记。 细胞因子在乙肝病毒感染后病毒清除的免疫机制中起重要的作用。我们既往曾对乙肝病毒宫内感染免疫耐受机制中细胞因子进行了研究。本课题选择对细胞因子基因启动子区单核苷酸多态性与乙肝病毒宫内感染易感性的关系进行研究。 第一部分 肿瘤坏死因子-α 基因多态性与乙肝 病毒宫内感染相关性的研究 目的 探讨肿瘤坏死因子-α基因-238位点和-308位点G/A单核苷酸多态性与乙肝病毒宫内感染易感性的关系。 方法 (1)应用实时荧光定量 PCR 技术检测乙肝病毒标志物阳性母亲所生45 例乙肝病毒宫内感染儿童(Ⅰ组)和 85 例宫内未感染儿童(Ⅱ组),以及 126 1复旦大学博士研究生学位论文例对照组儿童(非 HBV 高危儿童,下同)肿瘤坏死因子-α基因-238 位点基因型。(2)同法检测携带乙肝病毒标志物母亲所生 35 例乙肝病毒宫内感染儿童(Ⅰ组)和 91 例宫内未感染儿童(Ⅱ组),以及 117 例对照组儿童肿瘤坏死因子-α基因-308 位点基因型。 结果 (1)携带乙肝病毒标志物母亲所生婴儿组肿瘤坏死因子-α基因-238位点 G/A 等位基因频率与对照组相比,差异无显著性(x2=2.846,p>0.05);乙肝病毒宫内感染组(Ⅰ组)TNF-α基因-238 位点 A 等位基因频率显著高于乙肝病毒宫内未感染组(Ⅱ组)(x2=6.797,p<0.05)和对照组(x2=9.513,p<0.05),乙肝病毒宫内未感染组(Ⅱ组)和对照组之间差异无显著性(x2=0.047,p>0.05)。(2)携带乙肝病毒标志物母亲所生婴儿组肿瘤坏死因子-α基因-308位点 G/A 等位基因频率与对照组相比,差异无显著性(x2=0.051,p>0.05); 同样,乙肝病毒宫内感染组儿童(Ⅰ组)和宫内未感染组儿童(Ⅱ组)之间差异无显著性(x2=1.361,p>0.05)。 结论 肿瘤坏死因子-α基因启动子区-238 位点 A 等位基因与乙肝病毒宫内感染易感性相关,而-308 位点 A 等位基因与乙肝病毒宫内感染易感性无关。 第二部分 肿瘤坏死因子-α-238 位点 G/A 单核苷酸多态性 对其表达量的影响 目的 在实验对象范围内分析肿瘤坏死因子-α-238 位点 G/A 单核苷酸多态性是否影响其表达量。 方法 在第一部分研究结果的基础上,我们选择了乙肝病毒标志物阳性母亲所生婴儿中肿瘤坏死因子-α基因-308 位点同为 GG 基因型中-238 位点为 GG(Ⅰ组)和 GA(Ⅱ组)二种基因型的人群进行研究,其中,Ⅰ组 13 例,Ⅱ组 7例。我们分离上述研究对象外周血单个核细胞,统一浓度培养 48 小时后,用ELISA 的方法检测其培养上清液中的肿瘤坏死因子-α的浓度。 结果 Ⅰ组 TNF-α含量为 722±249(pg/ml,x±s),Ⅱ组为 804±209(pg/ml,x±s),二者比较差异无显著性(t=0.738,p>0.05) 结论 在实验对象范围内肿瘤坏死因子-α-238 位点 GG 和 GA 基因型对其表达量没有影响。 第三部分 白细胞介素-4 基因-590 位点 C/T 单核苷酸多态性 与乙肝病毒宫内感染相关性的研究 目的 探讨白细胞介素-4 基因-590 位点 C/T 单核苷酸多态性与乙肝病毒宫内感染易感性的关系。 方法 应用实时荧光定量 PCR 技术检测乙肝病毒标志物阳性母亲所生 36 例 2复旦大学博士研究生学位论文乙肝病毒宫内感染儿童(Ⅰ组)和 102 例宫内未感染儿童(Ⅱ组),以及 120 例对照组儿童白细胞介素-4 基因-590 位点基因型。 结果 实验组(乙肝病毒标志物阳性母亲所生婴儿组)白细胞介素-4 基因-590 位点 C/T 等位基因频率与对照组相比差异无显著性(x2=0.061,p>0.05)。在实验组中,乙肝病毒宫内感染组(Ⅰ组)与乙肝病毒宫内未感染组(Ⅱ组)比较差异无显著性(x2=0.632,p>0.05) 结论 白细胞介素-4 基因-590 位点 C/T 单核苷酸多态性与乙肝病毒宫内感染易感性无关。第四部分 白细胞介素-10 基因-1082 位点 G/A 单核苷酸多态性 与乙肝病毒宫内感染相关性的研究 目的 探讨白细胞介素-10 基因-1082 位点 G/A 单核苷酸多态性与乙肝病毒宫内感染易感性的关系。 方法 应用 PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析的方法检测乙肝病毒标志物阳性
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