目的随着年龄增长,干细胞和其他成体细胞一样,都可发生衰老变化。已有研究发现,老年干细胞微环境对干细胞衰老具有促进作用,这已经成为制约老年患者接受干细胞移植治疗效果的原因之一。但是,目前老年干细胞微环境对骨髓间充质干细胞(MSCs)衰老的作用及其机制还不清楚。本实验通过制备年轻和老年大鼠血清,检测老年大鼠血清对MSCs衰老、增殖和存活以及Wnt/β-catenin信号通路的影响,探讨Wnt/β-catenin信号通路在MSCs衰老、增殖和存活方面的作用及其机制,为提高老年患者的干细胞移植疗效提供新的思路和可行性依据。方法取年轻(8～12周)和老年(64～72周)SD大鼠全血,制备年轻大鼠血清(young rat serum, YRS)和老年大鼠血清(old rat serum, ORS)。分离年轻SD大鼠(8～12周)MSCs。用含20%YRS或ORS的DMEM培养MSCs 36 h后,SA-β-半乳糖苷酶染色和活性氧(ROS)染色检测细胞衰老变化,MTT法检测细胞增殖状态。用H2O2处理细胞1 h模拟氧化应激微环境,AO/EB染色和Hoechest33342染色检测MSCs的凋亡,评价不同年龄血清培养条件下MSCs对氧化应激的耐受性。用Elisa法检测年轻和老年血清中Wnt 3a含量。通过免疫荧光染色和Western blotting检测细胞内Wnt/β-catenin信号通路下游信号分子β-catenin和GSK-3β的表达,RT-PCR检测Wnt/β-catenin信号通路靶基因c-myc的表达,研究ORS对Wnt/β-catenin信号通路的影响。设计与合成三条能靶向沉默β-catenin的siRNA (si-β-catenin),经检测si-β-catenin转染后细胞内β-catenin的表达,筛选有效抑制片段。Western blotting检测si-β-catenin转染后不同时间点β-catenin的表达,确定最佳转染抑制时间。为明确Wnt 3a对MSCs衰老的影响,分别在YRS中加入10 ng/ml、50 ng/ml或100 ng/ml Wnt 3a,采用SA-β-半乳糖苷酶染色观察不同浓度Wnt 3a对细胞衰老的影响。为进一步明确Wnt/β-catenin信号通路对细胞衰老、增殖、存活的影响,采用DKK1 (Wnt/β-catenin信号通路受体阻断剂)受体水平阻断Wnt/β-catenin信号通路以及用si-β-catenin干扰其下游信号分子β-catenin,实验随机分为四组,分别是YRS、ORS、ORS+DKK1和ORS+si-β-catenin组。SA-β-半乳糖苷酶染色和ROS荧光染色观察细胞衰老变化,MTT法检测细胞增殖能力,AO/EB染色和Hoechest33342染色观察细胞凋亡和存活。通过免疫荧光染色和Western blotting检测各组细胞内γ-H2A.X和p53蛋白表达,RT-PCR法检测各组细胞内p16INK4a、p53、p21 mRNA表达,探讨Wnt/β-catenin信号通路导致MSCs衰老的机制。结果SA-β-半乳糖苷酶染色和ROS荧光染色显示,ORS处理后衰老细胞数量增多,与YRS组比较,差异有显著性意义。MTT检测结果表明,ORS组MSCs的增殖能力较YRS组明显减弱。在氧化应激条件下,ORS组的凋亡和坏死细胞数目明显增加,与YRS组比较,差异具有统计学意义。Elisa检测结果显示,ORS中Wnt 3a含量明显高于YRS。用ORS处理36 h后,细胞内β-catenin表达增强,且主要分布于胞核内,而GSK-3β的表达减弱,与YRS组比较,差异有显著性意义。用DKK1受体阻断Wnt/β-catenin信号通路后,β-catenin的表达明显减弱,而GSK-3β的表达增强。ORS组细胞内c-myc mRNA的表达较YRS组明显增强,而用DKK1处理后,c-myc mRNA的表达显著降低。在YRS中加入不同浓度的Wnt 3a,观察对MSCs衰老的影响,结果显示10 ng/ml Wnt 3a和50 ng/ml Wnt 3a对细胞衰老没有明显影响,但当Wnt 3a浓度增加至100 ng/ml时,衰老细胞数量明显增加,与YRS组比较,差异具有统计学意义。合成的siRNA经筛选后确定si-β-catenin2为有效沉默β-catenin的siRNA片段,最佳沉默时间为48 h。在ORS培养条件下,用DKK1受体阻断或si-β-catenin干扰P-catenin表达后,SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞数量减少,与ORS组比较差异有显著性意义。ROS染色结果显示,ORS+DKK1组和ORS +siβ-catenin组的ROS阳性细胞数量明显减少,荧光强度减弱。用DKK1或si-β-catenin阻断Wnt/β-catenin信号通路后,细胞的增殖和存活能力较ORS组明显增强。ORS组细胞内的γ-H2A.X和p53蛋白以及p16INK4a、p53和p21 mRNA表达明显升高,与YRS组比较差异有统计学意义。用DKK1或si-β-catenin阻断Wnt/β-catenin信号通路后,γ-H2A.X和p53蛋白以及p16INK4a、p53和p21 mRNA的表达降低。结论在体外培养条件下,ORS能促进MSCs衰老,并抑制其增殖和存活能力。ORS培养可以激活MSCs内Wnt/β-catenin信号通路。激活的Wnt/β-catenin信号通路可导致MSCs衰老,抑制Wnt/β-catenin信号通路可以延缓细胞衰老,提高细胞增殖和存活能力,Wnt/β-catenin信号通路在ORS所导致的MSCs衰老中发挥重要调控作用。DNA损伤反应和p53/p21途径在Wnt/β-catenin信号通路导致的MSCs衰老中发挥重要介导作用。
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