目的1)诱导耳蜗非感觉上皮产生异位新生毛细胞；2)在个体细胞水平上对比新生的异位毛细胞与固有毛细胞的异同；3)观察细胞间相互作用对新生感觉细胞细胞命运的影响；4)从整个非感觉上皮区观察异位新生感觉细胞群体的运动轨迹,与固有Corti器感觉上皮发育过程之间的共同点,暨发育中汇聚伸展现象在体外再生过程中的重现；5)探索新生感觉细胞相互作用及群体汇聚迁移运动的可能因素。 方法本实验以新生大鼠为研究对象。应用耳蜗基底膜体外培养技术,体外构建表达EGFP绿色荧光蛋白标记物或及表达math1基因的腺病毒载体(Ad-EGFP, Ad-EGFP-math1),感染基底膜,使被感染细胞过度表达math1基因,从而在非感觉上皮区产生异位新生毛细胞；应用免疫荧光组织化学技术分析受感染细胞到新生毛细胞或新生支持细胞的命运转化,分析新感觉细胞个体及群体的迁移特点；利用扫描电子显微镜、热场发射电子显微镜,观察在诱导细胞转化过程中非感觉上皮区细胞形态的转变、尤其是纤毛的再生过程,毗邻细胞之间的相互作用,以及整个上皮细胞区的移动；采用半透膜共培养体系以及同皿共培养体系,观察耳蜗不同部位组织之间的相互作用,初步探讨再生感觉细胞上皮群体移动的信号的来源和传递方式,及其从耳蜗底圈到顶圈的运动差异；以倒置荧光显微镜观察培养中的组织及其荧光标记,以正置荧光显微镜及共聚焦显微镜采集组织铺片的抗体荧光标记；以活细胞荧光实时监测系统监测组织中细胞的群体移动。 结果1)体外培养的耳蜗基底膜的非感觉上皮细胞,包括Corti器内侧的大上皮嵴区(Greater epithelial region, GER)和Corti器外侧体外增殖的非感觉细胞区(lateral non-sensory region, LNSR),过表达math1基因均可以产生异位新生的毛细胞,但GER区与LNSR区在感染编码math1的腺病毒后产生新生毛细胞的过程不尽相同；2)这些新生毛细胞与固有毛细胞高度相似,共同特点有：细胞呈圆形或梨形的立体形态,毛细胞的特异性分子标志物myosinⅦa阳性,具有表皮板,有形态近似成熟的静纤毛束,能形成长而粗大的动纤毛；3)静纤毛束的产生过程,是单根纤毛从延长的细胞表面微绒毛形态,到具有纤细坚韧的根部、直立的体部和纺锤尖的顶部形态的静纤毛,从倒伏弯曲到束状直立在毛细胞顶部,并形成有梯度排列的静纤毛束,期间伴随着静纤毛间的侧连接由无到有,再由多到少的过程。梯度排列的静纤毛之间可见顶连接。有的新生毛细胞可见动纤毛；4)部分感染编码math1基因腺病毒的细胞转化为新的支持细胞,表现为细胞形态由扁平变为立体,呈杯状或渗出指状突起,包绕邻近新生毛细胞；毛细胞标记物myosin7a呈阴性,而支持细胞的标记物GFAP呈阳性。同时新生的支持细胞能够转移到在结构上与其密切相关的新生毛细胞的下层,正如固有的毛细胞和支持细胞一样,被感染的上皮趋向于形成上下两层细胞的听觉感觉上皮结构,将其合称为新生毛细胞-支持细胞单位；5)新生的感觉细胞能够运动和迁移,整合入Corti器固有毛细胞中。GER的新生毛细胞以个体细胞的方式插入Corti器；而LNSR的新生毛细胞则表现为细胞群体从最外侧向内侧蜗轴方向变窄、迁移,最终集体整合入Corti器的外毛细胞,固有外毛细胞也在被插入的过程中受到影响而重新排列,这一过程与发育中感觉上皮的平面细胞极性汇聚伸展的特点高度相似；6)LNSR新生感觉上皮的迁移过程,在同样的时间,靠近耳蜗基底端的比靠近蜗尖的组织变窄更快,且更早的整合入Corti器。在共培养条件下,靠近基底段的组织,能够吸引基底段和蜗尖段产生的LNSR新生感觉上皮,一致向基底段的Corti器迁移,而远离蜗尖段的Corti器。7)与内侧的Corti器有连接的LNSR新生感觉上皮,能够产生向内的汇聚运动和向Corti器的整合,而与内侧的Corti器无细胞连接的LNSR感染的上皮,可以产生新的毛细胞,但是不能发生任何群体迁移及变窄的过程。 结论1)GER和LNSR的非感觉上皮细胞均可作为新生毛细胞的来源。2)新生毛细胞的静纤毛有序排列,依赖于静纤毛间侧连接的机械牵拉和动态重塑。3)受感染过表达math1的细胞一部分转变为新毛细胞,一部分转变为新支持细胞,这与发育过程支持细胞和毛细胞具共同的表达math1的前体细胞相似；4)细胞最终分化命运的选择,与相邻细胞间的相互作用有关,可能与math1的表达先后及表达量多少有关。5)新生的感觉细胞群体能够向内迁移,整合到Corti器内固有的毛细胞,这正是毛细胞再生研究的目标之一,是对毛细胞再生的治疗的一大鼓舞。而在整合过程中,LNSR能够重现具有发育过程中感觉上皮的平面细胞极性汇聚伸展的特点,其迁移过程的诱导信号来源于内侧的固有Corti器。而这个诱导信号需要通过细胞间连接的存在,即从细胞到细胞传递,而这同时提示我们,在内耳干细胞移植的研究中,移植入内耳的干细胞漂浮在内淋巴液不能与Corti器产生细胞连接,可能是干细胞移植成功率不高的原因。
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