第一部分TRPC6通道和T/L型电压门控钙通道对培养的食管鳞癌细胞株Eca109细胞增殖和细胞周期的影响 目的探讨TRPC6通道和T/L型电压门控钙通道(T/L-voltage gated calciumchannels,T/L-VGCCs)对食管鳞癌细胞株Eca109细胞增殖和细胞周期的影响。方法选择表达TRPC6通道和T/L-VGCCs的食管鳞癌细胞株Eca109细胞作为研究对象;①采用细胞计数的方法了解TRPC6通道阻断剂SKF96365阻断TRPC6通道后对Eca109细胞增殖的影响;②采用细胞计数的方法了解T-VGCCs抑制剂mibefradil对Eca109细胞增殖的影响;③采用细胞计数的方法了解L-VGCCs抑制剂nifedipine对Eca109细胞增殖的影响;④采用流式细胞术方法了解TRPC6通道阻断剂SKF96365阻断TRPC6通道后对Eca109细胞周期的影响;⑤采用流式细胞术方法了解T-VGCCs抑制剂mibefradil对Eca109细胞周期的影响;⑥采用流式细胞术方法了解L-VGCCs抑制剂nifedipine对Eca109细胞周期的影响。结果①TRPC6阻断剂SKF96365能够明显抑制Eca109细胞的增殖;T-VGCCs抑制剂mibefradil也能够明显抑制Eca109细胞的增殖;而L-VGCCs抑制剂nifedipine对Eca109细胞增殖没有影响;②SKF96365处理Eca109细胞后,处于G2/M期的细胞比例增加,而处于G0/G1期的细胞比例下降;mibefradil处理Eca109细胞后,处于G0/G1期的细胞比例增加,而处于G2/M期的细胞比例下降;而nifedipine处理Eca109细胞后对细胞周期没有影响。 结论阻断TRPC6通道或者T-VGCCs能够抑制食管鳞癌细胞株Eca109细胞的增殖,并分别把其细胞周期阻滞在G2/M期和G0/G1期;阻断L-VGCCs对于食管鳞癌细胞株Eca109细胞增殖和细胞周期均没有影响。 第二部分阻断TRPC6通道导致食管鳞癌细胞株Eca109 G2/M期阻滞可能机制的探讨 目的探讨TRPC6通道参与调控食管鳞癌细胞株Eca109细胞周期的可能机制。 方法选择表达TRPC6通道的食管鳞癌细胞株Eca109细胞作为研究对象:①构建特异性绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)腺病毒载体、构建TRPC6显性突变基因(dominant negtive TRPC6,DNC6)腺病毒载体、构建TRPC6野生型(wild type,WTC6)腺病毒载体;②腺病毒载体转染Eca109细胞后,用荧光显微镜和western blot的方法检测腺病毒载体的转染效率;③用western blot的方法检测阻断TRPC6通道后,cdc25A、cdc25B和cdc25C蛋白表达水平的变化;④用RT-PCR的方法检测阻断TRPC6通道后,cdc25A、cdc25B和cdc25C mRNA表达水平的变化。 结果①荧光显微镜观察腺病毒载体转染效率可达90%以上;②western blot结果显示阻断TRPC6通道可以明显抑制cdc25C蛋白表达,而对cdc25A和cdc25B蛋白表达没有明显影响;③RT-PCR结果显示阻断TRPC6通道可以明显降低cdc25C mRNA水平,而对cdc25A和cdc25B mRNA水平没有明显影响。 结论阻断TRPC6通道通过抑制cdc25C的表达,使磷酸化的cdc2不能去磷酸化而失活,导致食管鳞癌细胞株Eca109细胞周期阻滞在G2/M期,从而抑制食管鳞癌细胞的增殖。 第三部分培养的食管鳞癌细胞株ECa109细胞内源性TRPC6通道的功能性探讨 目的在培养的食管鳞癌细胞株Eca109细胞上研究TRPC6通道的功能。 方法①应用钙成像的方法来检测细胞内钙离子浓度的变化。选择Fura 2-AM作为荧光探针,检测340nm和380nm这两个荧光的比值来反映给予不同药物处理后细胞内的钙离子浓度的变化。②通过穿孔膜片钳来验证是否TRPC6通道在Eca109细胞膜上介导了功能性的膜电流。 结果①UTP刺激Eca109细胞诱导的胞外钙离子内流不能被mibefradil或者nifedipine阻断,但能被TRPC6通道的阻断剂La~(3+)、2-APB完全阻断;②UTP诱导的电流反转电位接近于0mV,是非选择性阳离子通道;UTP诱导的电流能被La~(3+)或者2-APB阻断,而mibefradil对其没有影响。 结论钙成像和电生理的结果表明UTP能激活Eca109细胞内源性TRPC6通道,并使胞内钙离子浓度持续升高。无论是T-VGCCs抑制剂mibefradil还是L-VGCCs的抑制剂nifedipine均不能阻断UTP诱导的胞内钙离子升高,这说明是TRPC6通道而不是VGCCs介导了UTP刺激Eca109细胞诱导的胞外钙离子内流。 第四部分TRPC6通道对食管鳞癌细胞株Eca109裸鼠皮下移植瘤增殖的实验研究 目的进一步在动物模型上探讨TRPC6通道在食管鳞癌发生、发展中的作用。方法本部分实验共使用18只雄性裸鼠,随机分为GFP、DN6和WTC6三组,每组6只。分别在裸鼠皮下注射转染腺病毒载体GFP、DNC6和WTC6的食管鳞癌细胞株Eca109(7.5×10~5)。观察裸鼠的一般情况,每隔两天测量裸鼠皮下移植瘤的体积并绘制生长曲线。第4周后处死裸鼠,取出皮下移植瘤,拍照并称重。 结果与GFP和WTC6组相比,Ad-DNC6明显延缓了裸鼠皮下移植瘤的生长速度。GFP、Ad-DNC6和WTC6组的皮下移植瘤重量分别为0.487±0.06g、0.028±0.03g和0.545±0.17g,其中DNC6组和另外两组相比有显著性差异(P＜0.01)。 结论TRPC6通道在食管鳞癌的发生、发展中发挥重要的作用并可能成为治疗食管鳞癌的新靶点。
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