转化生长因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)超家族是由一类结构和功能相关的多肽生长因子亚家族组成,包括TGF-βs、激活素、抑制素、骨形态发生蛋白(BMP)等。TGF-β家族广泛存在于多种生物的各种组织中,参与细胞增殖分化、胚胎发生、血管形成、肿瘤发生、细胞外基质形成、骨骼形成与重建等。TGF-β作用于效应基因的机制非常复杂,其信号转导主要通过激活Smad通路实现。而Smad泛素化调节因2 (Smad ubiquitination regulatory factor 2, Smurf2)与多种Smads的相互作用。作为调控Smad重要因子, Smurf2选择性地降低TGF-β应答的Smad2, Smad3水平,部分降低BMP应答的Smadl的水平。核内Smurf2与Smad7结合后也能出核聚集到TGF-β受体上,从而引起TGF-β受体通过泛素蛋白酶体途径降解。本文的创新点和着重点就是发现一个新颖的能够和Smurf2互作的环指蛋白RLIM,并且发现RLIM通过与Smurf2的相互作用调节TGF-β和BMP通路,并在癌症发生和间充质干细胞成骨分化的过程产生相应的生物学效应。 在实验室原有成员发现RLIM可以分别和p53,Hdm2结合并相互作用后,我通过甘油密度梯度离心实验首次验证RLIM,P53和Hdm2三者之间能够相互作用形成三联复合体。由于p53和Hdm2均在细胞生长调控方面起重要作用,这预示着RLIM在细胞生长方面也有着重要的调控作用。接着,我通过软琼脂克隆分离法和测生长曲线的方法证明了RLIM对细胞生长确实有抑制作用。由于TGF-β通路被广泛的报道参与抑制细胞生长的调控,而已有的文献中,有多个和RLIM同源性较高的环指蛋白已经被报道可以激活TGF-β信号通路,如RNF11,RNF111。据此,并通过多种生物信息学软件进行分析后,我们猜想与RNF11,RNF111在环指区域高度同源的RLIM也可以特异性的激活TGF-β信号通路和BMP信号通路,并且RLIM激活TGF-β信号通路和BMP信号通路的路径之一就是通过RLIM和Smurf2的相互作用来实现。 为印证这一猜测,我们首先采用双荧光色检测系统初步判定环指蛋白RLIM (RNF12)对TGF-β和BMP通路信号值有明显促进作用；荧光共定位试验证明RLIM和Smurf2之间存在细胞共定位现象；经外源转染细胞和内源免疫共沉淀的实验,我们进一步验证了RLIM和Smurf2之间有相互作用。通过体内泛素化实验,我们证明Smurf2在U20S细胞中可以泛素化RLIM并且通过蛋白酶体单向降解RLIM,而RLIM不能降解Smurf2。因此,我们认为RLIM通过Smurf2激活TGF-β和BMP通路的机制是,RLIM可以通过与R-Smads竞争Smurf2,从而减少了R-Smads被降解的量,促进了TGF-β/BMP信号转导通路的激活。我们通过在U20S细胞中外源梯度转染实验也证实了RLIM确实能增强Smad1, Smad2, Smad3在细胞中的稳定性。 接下来,我们进一步分析了RLIM的生物学的功能。细胞划线试验证明,RLIM在TGF-β蛋白的刺激下对U20S细胞的迁移有显著的促进作用。碱性磷酸酶活性测定和染色试验发现在BMP9的刺激下,RLIM对C3H10 T1/2细胞有显著的促成骨分化作用。而这种RLIM的促分化作用能被Smurf2蛋白抑制。茜素红染色试验也有相似的结果。最近我们也发现,RLIM蛋白可以和Smad7互作,并能在体内降解Smad7。这提示我们RLIM对TGF-β和BMP通路的激活也有可能通过降解Smad7来实现。我们第一部分的工作为揭示RLIM的在细胞内的分子机制和其生物学功能提供了有益的启示。 我们第二部分的工作是关于TGF-β基因多态性与乳腺癌相关性的研究。转录生长因子β1 (TGF-β1)是一个TGF-β家族中一个成员,与TGF-β2有71%氨基酸同源性,TGF-β1与TGF-β3有77%同源性。作为一个重要的细胞激酶,TGF-β1在控制乳腺癌细胞生长、转移方面起重要作用。TGF-β1的单核苷酸的多态性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNP)被广泛的报道与多种人群疾病相关联。有研究报道表明,TGF-β1的29T/C和-509C/T两个位点多态性与乳腺癌发病有关。但是,对这两个多态和乳腺病发病风险相关性的流行病学研究仍然没有取得一致的结论。Meta—分析(Meta-analysis)被认为可以有效解决关联分析中由于样本量不足而导致的统计效力较低的缺陷,另外也可以发现各研究之间异质性的来源和其他可能存在的问题,所以其目前在基因和复杂疾病易感性之间关系的研究方面应用非常广泛。因此,为了作出更精确的判断和结论,在本课题的第二部分中我们采用Meta荟萃分析的方法对上述两个多态与乳腺病相关性进行研究。其中,对29T/C多态和乳腺癌相关性的Meta分析(有15篇文献,10,341病例和15,655对照)表明29T/C多态与乳腺癌发生没有关系。显性模型和隐性模型分析的结果分别为[odds ratio (OR)=0.97,95% confidence intervals (CI):0.87-1.07]和(OR=1.03,95%CI：0.94-1.12)。对数据进行进一步经期状态和人种分层后,29T/C多态与乳腺癌依然没有相关性。对-509C/T多态和乳腺癌相关性的Meta分析(有7篇文献,5,825病例和7,953对照)表明-509C/T多态与乳腺癌发生没有关系。显性模型和隐性模型分析的结果分别为(OR=1.00,95%CI：0.86-1.17)和(0R=1.04,95%CI：0.94-1.16)。对数据进行进一步人种分层后,-509C/T多态与乳腺癌也依然没有相关性。但是,由于数据遴选的局限性,再者由于TGF—β1在癌症发生,发展和转移的不同发展阶段所起的作用也不同,今后仍然需要有更大规模和更细致分层的研究进一步探究TGF—β1的29T/C和-509C/T两个位点多态性与乳腺癌的关系。
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