E3泛素连接酶Prp19对肝癌侵袭的影响及其机制研究  学位论文  

前期工作发现去泛素化酶UCH37 (ubiquitin C-terminal hydrolase 37)促进肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)侵袭及术后复发。UCH37与E3泛素连接酶Prp19 (pre-mRNA processing factor 19)相互作用,抑制后者经泛素蛋白酶体途径降解。下调Prp19表达可抑制UCH37高表达的肝细胞迁移侵袭,因此Prp19可能在UCH37介导肝癌侵袭过程中起到重要作用。Prp19主要参与mRNA剪接体活化、DNA损伤反应、底物泛素化修饰。尽管上述活性异常与肿瘤发生关系密切,但Prp19在肝癌发生发展过程中的作用尚未有研究报道。因此,本研究的目的是分析Prp19在肝癌发展中的作用,并阐明Prp19对肝癌侵袭的影响及相关分子机制。本论文分成三个部分：第一部分Prp19表达与肝癌临床病理特征及患者预后的关系我们采用免疫组化染色(immunohischemistry staining, IHC)检测Prp19在169例肝癌组织和对应癌旁组织中的表达情况,同时通过免疫印迹方法检测11对癌组织与配对癌旁组织的Prp19表达。免疫组化结果显示在正常肝组织、癌旁组织和肝癌组织中Prp19的表达有逐步升高的趋势,且在多数肝癌组织中Prp19的表达要明显高于相应的癌旁组织。免疫印迹法检测结果表明在多数肝癌组织中Prp19的表达水平明显高于配对癌旁组织。肝癌内Prp19表达与临床特征相关性分析表明：与无侵袭或包膜完整的肝癌相比,血管侵犯或者包膜突破的肝癌中Prp19表达显著升高。随后采用Kapalan-Meier法及log-rank法,对HCC患者术后总体生存(overall survival, OS)及无瘤生存(disease-free survival, DFS)进行组间比较。利用Cox风险比例模型分析影响肝癌患者OS和DFS的独立危险因素,结果显示,Prp19高表达及低表达组患者间的DFS无显著差异；Prp19高表达组患者OS显著低于Prp19低表达组患者,但Prp19表达水平不是影响患者OS的独立危险因素。这一部分研究表明在肝癌中Prp19高表达,高表达的Prp19与血管侵犯及包膜突破正相关,并提示不良预后。第二部分Prp19对肝癌细胞生物学行为的影响本研究部分通过比较正常肝细胞及多种肝癌细胞Prp19的表达水平,构建Prp19过表达和下调的稳定单克隆肝癌细胞株,进一步研究Prp19对肝癌细胞生物学行为的影响。结果显示,Prp19对肝癌细胞增殖无显著影响；与载体对照相比,过表达Prp19明显增强肝癌细胞的体外迁移和侵袭能力,相反下调Prp19可抑制肝癌细胞的体外迁移和侵袭。裸鼠体内实验提示Prp19促进肝癌细胞的肺内定植及肝内转移。结合第一部分的临床样本发现,该部分的工作提示Prp19通过上调肝癌细胞的迁移和侵袭能力,促进肝癌血管侵犯及包膜突破。第三部分Prp19促进肝癌侵袭的相关机制探讨Prp19差异表达的稳定肝癌细胞株的形态学改变提示过表达Prp19可致肝癌细胞上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition, EMT),而下调Prp19可引起肝癌细胞间质上皮转化。肝癌细胞中过表达Prp19抑制上皮标志物E-cadherin、ZO-1的表达,增强间质标志物N-cadheri、p-catenin的表达；下调Prp19可上调E-cadherin的表达,抑制N-cadherin、p-catenin的表达。免疫组化及免疫印迹的结果表明在人肝癌组织内Prp19表达与EMT标志物表达存在相关性。在几种肝癌细胞中,与其他几种EMT转录因子相比,Prp19明显调控Twist1表达。抑制Twist1表达可以逆转Prp19诱导的肝癌细胞EMT,并抑制其迁移侵袭潜能,表明Twist1主要介导了Prp19对肝癌细胞EMT的调控作用。后续研究显示Prp19通过抑制Twist1经泛素蛋白酶体途径降解,维持Twistl稳定性。既往研究报道与其它转录因子形成异二聚体或者由MAPK (mitogen-activated protein kinase)通路介导的丝氨酸68位的磷酸化有利于维持Twistl的稳定性。在我们当前的研究中未发现肝癌细胞内Prp19与Twistl间存在相互作用。TTwist168位丝氨酸突变导致Twist1在肝癌细胞中的稳定性下降,并明显减弱Prp19对Twist1的上调作用,因此Prp19可能参与Twist1 68位丝氨酸的磷酸化,进而调控Twist1表达。进一步研究提示肝癌细胞中p38/MAPK活化水平与Twistl表达相关,p38/MAPK的失活可抑制Twistl总丝氨酸的磷酸化水平及Twistl表达,提示肝癌细胞中p38/MAPK信号通路参与了Twistl调控。Prp19在DNA损伤反应及mRNA前体剪接中的作用依赖于其对底物蛋白的K-63泛素化修饰,而这种修饰方式也参与了细胞信号通路的活化。在肝癌细胞中Prp19表达与p38/MAPK活化水平正相关,下调Prp19表达抑制了LPS(lipopolysaccharide)及TGF-β(transforming growth factor-β)诱导的p38/MAPK信号通路的活化。后续研究表明Prp19促进肝癌细胞中p38/MAPK上游因子MKK3/6(mitogen-activated protein kinase kinase 3/6)的活化。为了探讨Prp19激活p38/MAPK的机制,我们构建Prp19主要功能结构域缺失突变体。结果表明具有E3泛素连接酶活性的U-box结构域在Prp19诱导的p38/MAPK活化中起到了主要作用。在肝癌细胞中Prp19并不调控TAK1(TGF-p activated kinase 1)表达,而是与TAK1相互作用,并上调TAK1的K-63泛素化修饰,促进其下游MKK3/6及p38/MAPK的激活。在肝癌细胞中,抑制p38/MAPK的活性可明显抑制由Prp19上调所引起的Twist1表达。与空载对照组相比,抑制p38/MAPK的活性后,Prp19过表达的肝癌细胞侵袭能力无显著增加。IHC相关性分析提示肝癌组织内Prp19与p-p38的表达显著相关。此外在裸鼠原位肝癌内Prp19、p-p38、Twist1的表达存在一致性,进一步验证了Prp19/p-p38/Twist1通路参与了肝癌侵袭。综上所述,本研究首次报道了Prp19在肝癌中高表达,高表达的Prp19与血管侵犯、肿瘤包膜突破等侵袭特性密切相关。肝癌中Prp19高表达也提示预后不良。体内外功能研究验证了Prp19增加肝癌细胞迁移侵袭的潜能。后续机制研究阐明了Prp19与TAK1结合,上调TAK1的K-63泛素化修饰,激活p38/MAPK,促进Twistl丝氨酸位点的磷酸化,抑制其经泛素蛋白酶体途径降解,导致Twistl在肝癌细胞内积聚,从而诱导EMT发生,促进肝癌侵袭。该研究有助于了解肝癌的生物学特性及其侵袭相关分子机制,并为寻找肝癌转移的治疗靶点提供新的理论依据。