卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,在我国,妇科肿瘤中,卵巢癌的发病率仅次于乳腺癌和宫颈癌,是目前死亡率最高的妇科恶性肿瘤,而且其发病率近年呈上升趋势,严重威胁女性的健康。而70%的卵巢癌患者在就诊时已属晚期,发生腹腔播散转移,致使手术不能根治。化疗是卵巢癌包括失去根治手术机会的卵巢癌的重要辅助治疗手段,肿瘤减灭术后给予联合化疗是改善卵巢癌预后的关键措施。铂类化合物是诸多化疗药中最有效的,其中,顺铂是目前治疗卵巢癌最有效的首选化疗药物之一,有效率达29%-35%,顺铂的疗效呈明显的剂量依赖性,严重的肾脏毒性限制了其剂量的增加,而且容易产生耐药性,严重地阻断了化疗药物的抗肿瘤效应,目前对此尚无根本的解决措施。由于一线化疗后顺铂耐药的产生造成卵巢癌患者5年生存率较低,仅为20%-30%。卵巢癌的耐药性始终是影响化疗效果的最大障碍,因此对顺铂耐药的卵巢癌的治疗也成了当今研究的热点问题。 通过建立细胞系并对其进行体外培养,研究其在不同的生物环境和特定条件下的生物学行为和变化,是基础医学研究最基本和常用的方法。SKOV3细胞株是人卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞系,浆液性腺癌是卵巢癌中侵袭性和致死率最高的。在本课题中,我们用顺铂间歇诱导的方法建立SKOV3卵巢癌耐药细胞系,该细胞系对顺铂的抗肿瘤效应产生了抵抗,耐药细胞的形态发生了明显的变化,这为我们用耐药细胞系和亲本细胞系设立实验组奠定了基础。应用建立的耐药细胞株和亲本细胞株建立卵巢癌的移植瘤模型,为探索逆转卵巢癌的耐药性的方法以提高其对化疗药物的敏感性创造了有利的前提条件。 骨髓间充质干细胞(MSCs)是一种多功能干细胞,具备潜在的多向分化潜能,由Friedenstein等人于40多年前发现。在合适的环境条件下MSCs可向特定的细胞方向如脂肪、软骨、骨组织等分化。这一特性使得MSCs具有用于多种治疗方法的潜能,如组织再生、治疗遗传性疾病、减轻炎症反应和作为载体递送药物等。MSCs细胞最主要的功能是提供组织的主要构架,从而保证造血细胞系统的机械性支撑。因此,基于MSCs的细胞疗法已成为治疗许多疾病的一种很有应用前景的新策略。 本课题即是应用干细胞治疗实体肿瘤卵巢癌的探索性研究。有文献报道称肿瘤组织有吸引自体骨髓间充质干细胞向其区域聚集的作用。基于肿瘤组织的这一趋化特性,我们设想将MSCs静脉注射入耐药的卵巢癌荷瘤大鼠体内,使其形成干细胞血栓阻塞卵巢癌众多的毛细血管或者通过MSCs的分泌作用改变局部体液环境,从而减少甚至完全阻断肿瘤组织的血供,影响营养成分的吸收和血行转移,或者直接影响肿瘤细胞的生物学特性,最终导致肿瘤体积的缩小,为后续的手术和化疗提供更为有利的时机。 本研究主要分为以下三个部分： 第一部分顺铂耐药的卵巢癌细胞株SKOV3的建立复苏原始的卵巢癌细胞SKOV3,采用间歇诱导的方法,逐步去除对顺铂敏感的细胞,筛选出对顺铂耐药的卵巢癌细胞集落,并使其增殖,培养至生长状态良好,由此建立的耐药细胞株的耐药特性非常稳定。相差显微镜下观察,发现耐药的卵巢癌细胞与原始的卵巢癌细胞存在形态上的差异,后者细胞体积较大,胞浆丰富而耐药的细胞较小,胞浆较少,细胞的核浆比例升高,呈现出典型的干细胞生长特性。应用FITC标记的抗干细胞标记蛋白CD44的抗体,通过流式细胞仪检测,发现经过药物诱导后的SKOV3细胞CD44的表达高达99.3%,而原始的SKOV3细胞CD44分子的表达率仅为0.04%,证明顺铂耐药的卵巢癌细胞主要是肿瘤干细胞。 第二部分顺铂耐药的SKOV3细胞体外生物学行为的观察通过CCK8检测及黏附力实验,检测两种细胞的增殖及其与基质蛋白Matrigel的黏附力,观察耐药的卵巢癌细胞体外生物学行为的变化。结果发现用顺铂诱导后的SKOV3在再次加入顺铂后,在同样的处理下,细胞的增殖明显高于原始的SKOV3；耐药的SKOV3细胞的粘附力下降；通过对细胞周期的检测发现,经过药物诱导后的SKOV3细胞相对于原始的SKOV3细胞而言,停滞于细胞周期G1期的数量增加,而位于S期的细胞数量减少。说明顺铂耐药的SKOV3增殖较快,而与降低肿瘤转移有关的细胞黏附力较弱,同时对后续的顺铂不敏感。 第三部分骨髓间充质干细胞对顺铂耐药卵巢癌细胞SKOV3移植瘤的作用利用顺铂耐药的SKOV3细胞皮下注射至雌性裸鼠体内,建立顺铂耐药的卵巢癌大鼠模型,利用差速贴壁法及机械刮除法原代培养大鼠骨髓间充质干细胞,静脉注射至卵巢癌大鼠体内,以静脉注射PBS的卵巢癌大鼠作为对照,观察并比较肿瘤体积的大小。结果发现,静脉注射MSCs的荷瘤大鼠的卵巢癌体积较静脉注射PBS的荷瘤大鼠的卵巢癌体积为小,说明MSCs具有抑制顺铂耐药卵巢癌生长的作用趋势。 综上所述,我们通过药物间歇诱导的方法建立了对顺铂耐药的卵巢癌细胞株,并利用这一细胞株成功建立了顺铂耐药的卵巢癌小鼠荷瘤模型,并通过实验证明骨髓间充质干细胞在一定程度上可以抑制顺铂耐药卵巢癌的生长。
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