脑胶质瘤是临床发病率最高的脑肿瘤,是威胁人类健康的主要疾病之一,具有高复发率和高死亡率的特点。由于脑胶质瘤自身生长具有浸润性以及血脑屏障(BBB)的存在,使得常规的治疗方案包括手术切除、放疗或化疗均难以取得理想的治疗效果。烷化剂类抗肿瘤药物卡莫司汀(Carmustine, BCNU)通过将肿瘤细胞DNA鸟嘌呤上的第六位氧原子烷基化,促使DNA链间产生交联,从而影响DNA复制。但是由于肿瘤细胞中存在DNA修复酶,尤其是O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA-methyltransferase,MGMT),它可以将DNA鸟嘌呤上的烷基转移到自身,修复肿瘤细胞,从而导致肿瘤细胞对BCNU产生耐药性。06-苄基鸟嘌呤(O6-Benzylguanine, BG),通过直接消耗细胞中MGMT,达到有效逆转肿瘤细胞对烷化剂耐药性的作用。本课题以烷化剂BCNU为模型药物、BG为抗肿瘤增敏剂,采用可生物降解的乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和壳聚糖(CS)为纳米粒载体材料,制备核壳型双层纳米粒(PLGA/CS NPs)。以载有BCNU的PLGA为内核,分散有BG的CS为外壳,通过外层BG的释放,消耗肿瘤细胞中的MGMT,从而提高随后释出的BCNU抗肿瘤活性。 第一章的主要内容是BCNU与其增敏剂BG的处方前研究。建立了BCNU与BG的HPLC分析方法；考察了BCNU在不同条件下的稳定性,结果表明,BCNU在水溶液中的稳定性远远低于在有机溶剂中,且随着pH值的增大和温度的升高而降低。以MGMT水平较低的C6细胞、MGMT水平较高的F98细胞和人原代胶质母细胞(临床病理诊断IV级,HPG)为肿瘤细胞模型,考察BG对BCNU细胞毒性的增敏作用。结果表明,BG可以提高C6、F98和HPG细胞对BCNU的敏感性,其增敏程度与肿瘤细胞本身MGMT表达水平有关。此外,BG的给药浓度和给药时间均对其增敏作用有一定影响。 第二章为(BCNU+BG)-PLGA/CS双层纳米粒的制备和表征。首先以粒径、Zeta电位和BCNU载药量为指标进行单因素考察,包括PLGA分子量、PLGA浓度、CS分子量、CS浓度、表面活性剂、超声功率、油相／水相体积比和除去有机溶剂方式等。确定主要影响因素后,通过正交试验获得优化的处方和制备工艺。最优处方制备得到(BCNU+BG)-PLGA/CS纳米粒的粒径为177.1±3.2nm,Zeta电位为19.6±4.8mV,BCNU载药量为(3.05±0.32)%,BG载药量为(8.97±0.81)%。(BCNU+BG)-PLGA/CS纳米粒的Zeta电位随着溶剂pH值的增大而降低。透射电镜和扫描电镜结果显示,制得的纳米粒呈清晰的核-壳双层结构,形态较圆整,大小均一。 第三章对PLGA/CS双层纳米粒进行了体外评价。血浆中稳定性实验结果表明PLGA/CS纳米粒中BCNU的降解半衰期延长至BCNU原药的5倍。PLGA纳米粒和PLGA/CS纳米粒空白载体的溶血毒性均较低。以C6、F98和HPG细胞为肿瘤细胞模型,考察载药纳米粒的细胞毒性。结果表明,载药纳米粒组的细胞毒性均大于原药组,其中同时载BCNU和BG的纳米粒细胞毒性最强。在各给药组中,F98细胞与HPG细胞不仅对BCNU具有相似的耐药性,而且BG对两种细胞的增敏效果也一致,因此选择F98细胞作为耐药脑胶质瘤细胞模型,进行下一步体内外评价。制备载荧光探针(香豆素6)的纳米粒并进行表征,结果表明,载香豆素6的纳米粒和载药纳米粒具有相近的粒径和Zeta电位；此外,体外泄漏试验结果表明,纳米粒中香豆素6在24h的体外泄漏率低于2%,证明香豆素6是一种较为理想的荧光探针,可用于示踪纳米粒的体内外行为。采用倒置荧光显微镜和流式细胞仪观察F98细胞对纳米粒的摄取,结果表明,CS表面修饰可以显著增强细胞对纳米粒的摄取,而随着纳米粒粒径的增大,摄取量降低,且细胞摄取呈时间依赖性。F98细胞对纳米粒的摄取机理研究结果表明PLGA/CS纳米粒主要通过与细胞膜表面的负电荷发生静电作用,然后经网格蛋白介导和细胞膜穴样凹陷内吞入胞。 第四章考察了荧光探针标记的PLGA/CS双层纳米粒的体内分布。香豆素6和BG载入PLGA/CS纳米粒后在大鼠血浆中的滞留时间显著延长,表现为AUC、t1/2β和MRT显著增加。组织分布也发生显著变化,特别是在脑组织,载入PLGA/CS纳米粒后香豆素6和BG的AUC分别为对应溶液组的2.38倍和2.44倍；在肿瘤部位的AUC则分别提高了2.21倍和2.80倍。以上结果表明PLGA/CS纳米粒改变了药物的体内行为。 第五章以F98荷瘤大鼠为模型,对(BCNU+BG)-PLGA/CS纳米粒进行药效学和安全性评价。无论是游离药物组还是纳米粒组,BCNU联合BG给药后均能显著延长荷瘤大鼠的生存时间,其中纳米粒组平均生存时间和中位生存期最长,生存期延长率最大。相应地,通过MRI在体观察各给药组荷瘤大鼠的肿瘤生长情况,结果表明各给药组均能不同程度地抑制肿瘤生长,其中(BCNU+BG)-PLGA/CS纳米粒具有最强的抗肿瘤活性,该组荷瘤大鼠的平均肿瘤直径最小。此外,通过体重测定和神经学评分初步证明PLGA/CS纳米粒安全性较高。H&E染色和TUNEL法的结果表明,(BCNU+BG)-PLGA/CS纳米粒组中肿瘤细胞对正常脑组织的浸润度显著降低,肿瘤细胞的凋亡明显增加。 本课题构建了同时装载BCNU与BG的阳离子核壳型双层纳米粒(PLGA/CS NPs),显著延长了药物在体内的滞留时间,改善了药物跨过BBB的能力,进而提高了药物在肿瘤部位的蓄积。同时,一系列体内外研究结果证明载BCNU和BG的PLGA/CS纳米粒可以明显增强BCNU的抗肿瘤活性。
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