急性缺血性卒中是临床常见疾病,具有很高的发病率、死亡率和致残率。脑缺血再灌注时可出现严重的微循环障碍,所产生的低灌流、无复流等现象,是导致半影区神经元损伤的首要环节。因此,改善微循环障碍在急性脑缺血损伤治疗中具有重大意义。脑缺血再灌后微循环障碍的表现之一即是血流量下降,针对其产生机制,目前主张应用抗血小板聚集、抗白细胞、抗细胞因子、抑制凝血酶生成、溶解纤维蛋白等疗法以促使血流恢复,但临床效果并十分理想。微循环障碍还表现为微血管的通透性增高。金属基质蛋白酶-9(matrix metalloproteinse-9,MMP-9)是近些年发现的损伤微血管、使其通透性增加的重要因素,但至今仍无抑制剂应用于临床。这一现状为中医药参与治疗急性缺血性卒中提供了一个宝贵的研究空间。虽然急性缺血性卒中的病机非常复杂,我们认为脑络瘀阻,气不行血是最基本最重要的病变环节。因此,本研究观察目前中西医结合卒中临床最常用的益气活血方剂补阳还五汤,对脑缺血再灌后半影区微循环血流量及微血管通透性的改善作用,并探讨其改善微血管通透性的作用机理。目的 观察补阳还五汤对脑缺血再灌后微循环血流量及微血管通透性的影响,阐明MMP-9在微血管损伤中的重要意义,探讨补阳还五汤保护微血管的作用机理。方法 采用Zea Longa线栓法建立短暂性大鼠大脑中动脉阻塞 (middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。动物随机分为假手术组、模型组、尼莫地平组(NIM)和补阳还五汤组(BYHWT),每组每个时间点8只动物。BYHWT组分别于MCAO即刻和拔线再灌时腹腔注射补阳还五汤(16g/kg);NIM组以尼莫地平(1.5mg/kg)替代补阳还五汤,余同BYHWT组;模型组以等体积生理盐水替代补阳还五汤,余同BYHWT组;假手术组以等体积生理盐水替代补阳还五汤。再灌注后以四氮唑红染色测定大鼠脑梗死灶体积,Zausinger六分法评定神经功能缺损,闭合式颅窗法测定缺血半影区血流量,伊文思蓝(Evan’s blue,EB)染色测定血脑屏障(blood brain barrier,BBB)通透性并以透射电镜观察其形态结构,RT-PCR测定MMP-9基因表达,明胶酶谱法测定蛋白表达。结果 (1)模型组再灌48h脑梗死灶体积为146.78(35.45 mm3,NIM组为89.96(27.65 mm3 ,BYHWT组为94.71(23.05 mm3,NIM组、BYHWT组与模型组相比有极显著性差异(P<0.01),BYHWT组与NIM组比较无显著性差异(P>0.05)。(2)假手术组动物无神经功能缺损,模型组再灌48h神经功能缺损评分为2.63(0.74,NIM组为4.50(0.76,BYHWT组为4.38(0.74。NIM组、BYHWT组与模型组相比,有极显著性差异(P<0.01),BYHWT组与NIM组相比,无显著性差异(P>0.05)。(3)再灌20min、60min、120min、180min,模型组血流量分别为180.3(40.1%、62.3(14.5%、50.4(21.4%、50.5(20.4%,NIM组血流量分别为95.3(12.5%、89.6(19.5%、70.3(10.6%、70.9(15.8,BYHWT组分别为91.4(22.3%、84.6(14.6%、72.1(13.7%、74.1(23.3%。NIM组、BYHWT组与模型组相比,各时间点均有统计学差异,(P<0.05或P<0.01)。BYHWT组与NIM组相比,各时间点均无显著性差异(P>0.05)。(4)再灌后1h、3h、24h、48h、120h,假手术组大鼠脑组织EB含量在0.417-0.463(ug/g湿重脑组织)之间,模型组EB含量分别为3.65(0.55、6.74(0.81、4.58(0.57、8.55(3.28、3.54(0.95(ug/g湿重脑组织),NIM组分别为3.02(0.36、5.72(1.01、3.18(0.78、4.99(1.18、2.34(0.68(ug/g湿重脑组织),BYHWT组分别为3.11(0.35、5.99(0.54、3.64(0.64、4.26(1.86、2.54(0.59(ug/g湿重脑组织)。NIM组、BYHWT组与模型组相比,有统计学差异(P<0.05或P<0.01),BYHWT组与NIM组相比,无显著性差异(P>0.05)。(5)假手术组大鼠BBB超微结构表现为血管内皮细胞呈扁平状、结构完整;内皮细胞所含的吞饮小泡很少;细胞间有紧密连接存在,表现为相邻细胞间深染的致密条带;内皮细胞外有双层连续的血管基膜。模型组再灌3h内皮细胞间紧密连接及血管基膜无明显异常改变,但内皮细胞水肿,胶质疏松,内皮细胞中吞饮小泡明显增多,星形胶质细胞足突也出现水肿;再灌48h有些BBB结构存在,内皮细胞中吞饮小泡增多不明显,血管基膜结构也尚无明显异常改变,但细胞间紧密连接开放,表现为电子深染物质减少,有些BBB结构则完全破坏,内皮细胞模糊不清、毛细血管已被溶解。NIM组大鼠再灌3h,内皮细胞间紧密连接及血管基膜无明显异常,内皮细胞水肿明显减轻,内皮细胞中仍可见吞饮小泡,但比模型组明显减少,管周水肿也好转;再灌48h BBB的结构损伤较模型组减轻,紧密连接存在,血管基膜较连续。BYHWT组大鼠BBB的变化与NIM组类似。(6)再灌后1h、3h、24h、48h、120h,假手术组MMP-9基因表达分别为0.192±0.044、0.196±0.028、0.201±0.025、0.223±0.038、0.216 ±0.037,模型组分别为0.192±0.049、0.204±0.042、0.609±0.166、0.731±0.122、0.566±0.112,BYHWT组分别为0.242±0.074、0.250±0.068、0.427±0.108、0.584±0.125、0.342±0.176。BYHWT组与模型组相比,再灌24h、48h和120h MMP-9 mRNA含量下降,有显著性差异(P<0.05)。(7)假手术组未检测到MMP-9蛋白。模型组再灌48h MMP-9酶原为0.785(0.246(辉度面积/mg·mL-1)。模型组再灌24h活性MMP-9为5.11±0.79,48h为
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