急性心肌梗死(AMI)及其引起的心力衰竭是目前世界范围内危害人类健康的重要疾病,近20余年来以干细胞治疗为代表的心肌再生医学成为动物实验和临床研究的热点,干细胞疗法已成为治疗AMI最有前途的方法之一,但多项临床研究均提示骨髓干细胞治疗对AMI后心功能的改善非常有限。移植后干细胞存活率低下是制约干细胞治疗效果的重要因素。有研究表明移植4天后局部干细胞的存活率仅为0.44%,随着时间的进一步延长,干细胞在心肌局部的存活率继续显著降低。基于这些研究发现我们有理由相信提高干细胞的存活率无疑可显著提高干细胞的治疗效果。 硫化氢是继一氧化氮、一氧化碳后发现的存在于人体内的第三类气体信号分子。其参与体内多个生理过程包括细胞保护、血管新生、血管扩张及抗动脉粥样硬化作用。虽然其细胞保护作用在多种细胞中发现,但目前尚无硫化氢与干细胞相互作用的相关研究。 本文着眼于提高干细胞存活率这一影响干细胞治疗效果的重要因素,从硫化氢对骨髓间充质干细胞的可能作用入手,分为体内、体外两个主要部分探讨了硫化氢对骨髓间充质干细胞的保护作用及其机制。 本实验主要分为以下三个部分： 第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及纯化 目的：分离培养符合实验要求的大鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定,为此后进一步的实验研究奠定基础。 方法：全骨髓培养法培养大鼠骨髓间充质干细胞并传代培养,观察培养细胞的形态及生长过程。以流式细胞仪鉴定其表面抗原,并检测体外标准诱导条件下该类细胞向脂肪细胞分化的能力。 结果：原代细胞呈梭形或不规则形,贴壁集落生长。体外传代培养2代后细胞呈较均一性成纤维样,均匀生长。流式细胞仪检测细胞表面抗原,结果表明培养细胞强表达干细胞标记CD90,而少表达造血干细胞抗原CD34。标准成脂诱导条件下,油红染色证实其可向脂肪细胞分化。 结论：全骨髓贴壁培养法可获取较高纯度的大鼠间充质干细胞,满足体内外实验要求。 第二部分硫化氢对缺氧诱导大鼠骨髓间充质干细胞凋亡的保护作用及机制研究 目的：证实硫化氢预处理对缺氧诱导间充质干细胞凋亡的潜在保护作用,并初步探讨其机制。 方法：体外分离培养、扩增大鼠骨髓间充质干细胞；建立体外缺氧诱导细胞凋亡模型；给予或不给予细胞硫化氢预处理,缺氧诱导后流式细胞仪及荧光显微镜检测细胞凋亡,台盼蓝染色及CCK-8法检测细胞活力；荧光显微镜检测细胞内活性氧水平；Western blot检测pAkt、pErk1/2、peNOS、pFox01、pGSK-3β、Fox01、Akt、Erk1/2、Pim-1、Bcl-2及Bax的表达变化。划痕实验评价硫化氢预处理对间充质干细胞迁移作用的影响。ELISA法检测培养液上清VEGF水平评价硫化氢预处理对干细胞旁分泌的影响。 结果：无糖、无血清培养条件下缺氧6小时可成功诱导间充质干细胞凋亡；10-300μmol/L硫化氢预处理30分钟可浓度依赖性减少缺氧诱导的细胞凋亡；此后本实验采用200μmol/L硫化氢作为干预浓度；结果提示200μmol/L硫化氢预处理可明显减少缺氧条件下细胞凋亡,流式检测细胞凋亡率由25.45%降至14.09%(P<0.05),200μmol/L硫化氢预处理可增强细胞活力(台盼蓝染色：67%vs 46%,P<0.05;CCK-8:52% vs 38%,P<0.05),此外硫化氢预处理还可明显减少缺氧诱导的细胞内活性氧水平升高；Western blot表明硫化氢预处理可明显提高间充质干细胞内Akt,Erk1/2及GSK-3β的磷酸化水平；并且在缺氧培养条件下显著上调Pim-1、Bcl-2的蛋白表达,抑制Bax的蛋白表达,提示硫化氢可能通过PI3K/Akt及MEK/Erk1/2/GSK-3β途径发挥细胞保护作用。硫化氢预处理对间充质干细胞迁移无明显影响,而且我们也未观察到其对干细胞旁分泌作用的影响。 结论：硫化氢预处理可明显减轻缺氧诱导的间充质干细胞凋亡,增强细胞活力。这种保护作用可能是通过激活PI3K/Akt及MEK/Erk1/2/GSK-3β途径并减少细胞内活性氧水平实现的。 第三部分硫化氢预处理骨髓间充质干细胞治疗大鼠急性心肌梗死的在体研究 目的：体外实验中硫化氢预处理可明显减少缺氧诱导的间充质干细胞凋亡,本部分实验主要研究硫化氢预处理是否可增强间充质干细胞治疗急性心肌梗死的疗效。 方法：体外分离培养、扩增雄性SD大鼠骨髓间充质干细胞。采用结扎前降支的方法建立大鼠急性心肌梗死模型,造模成功后即刻用微量注射器在左室前壁沿梗死边缘多点注射1×106个细胞／100ul或等量PBS。动物实验主要分为两个部分：(1)雌雄不匹配心肌梗死模型在体评价细胞移植后细胞存活率：选择雌性SD大鼠造模,移植细胞来源于雄性大鼠。造模成功后随机分为两组并进行干细胞移植：MSCs组心肌内注射1×106个未经硫化氢预处理的干细胞,H2S组心肌内注射1×106个硫化氢预处理的干细胞。4天后取材提取组织DNA,Real-time PCR检测sry基因评价干细胞存活率。(2)雌雄匹配模型评价细胞移植后心脏功能及左室重构：干细胞来源及造模动物均为雄性大鼠。造模成功后随机分为三组并进行干细胞移植：PBS组心肌内注射100μ1 PBS；MSCs组心肌内注射1×106个未经硫化氢预处理的干细胞,H2S组心肌内注射1×106个硫化氢预处理的干细胞。4周后心超评价左室收缩功能；Tunel法评价心肌细胞凋亡率；Masson染色评价梗死面积及心肌内纤维沉积情况；CD31免疫组织化学染色评价新生血管情况。 结果：4周后心超结果提示H2S组及MSC组心功能明显优于PBS组(LVEF:45.35±2.25% vs 36.92±0.79% vs 30.29±1.80%),且H2S组好于MSC组。虽然三组间心肌细胞凋亡无明显差异。但与PBS组相比,两组干细胞治疗均可减少心梗后梗死面积(30.30±3.37% vs 39.78±3.14% vs 49.12±2.25%)及心肌内纤维沉积,且H2S组的改善作用更为明显。免疫组化结果提示与PBS及MSCs组相比,硫化氢预处理后的干细胞治疗组毛细血管密度明显升高。Real-time PCR结果提示,细胞移植后4天H2S组的干细胞存活率是MSCs组的1.64倍。干细胞存活率的提高可能是硫化氢预处理干细胞更好保护心脏功能的主要机制。 结论：H2S预处理可提高在体干细胞存活率。H2S预处理干细胞有更强的心脏保护作用,改善的干细胞存活率可能是其心脏保护作用的主要机制。
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