目的：研究以聚乙烯亚胺-海藻酸(PEI-alginate)纳米粒为载体的siRNA干扰淋巴管内皮祖细胞(lymphatic endothelial progenitor cells,LEPCs)的VEGFR-3基因表达,探讨以LEPCs为靶点的抗肿瘤淋巴管新生的作用。<br> 方法：用ficoll密度梯度离心法从人脐带血中分离出单形核细胞,用抗VEGFR-3抗体标记后用流式细胞仪分选出VEGFR-3+细胞,用含有15％FBS、100IU/mL青霉素和100mg/L链霉素的DMEM培养液对分选后的VEGFR-3+内皮祖细胞进行培养,培养12h后分别进行CD34/VEGFR-3和CDl33/VEGFR-3免疫细胞双标记染色,在共聚焦激光扫描显微镜下观察分选的VEGFR-3+细胞的CD133和CD34的表达。通过VEGF-C诱导LEPCs向淋巴管内皮细胞(lymphatic endothelial cells,LECs)分化。在荧光显微镜下观察LEPCs分化过程中CD133和LYVE-1的表达。采用PEI和alginate合成纳米粒载体,扫描电镜和zeta电位仪检测纳米载体的形态、大小和电位。按照基因序列化学合成VEGFR-3siRNA。凝胶电泳阻滞分析检测PEI-alginate纳米粒对siRNA的包封效率;MTT法检测纳米粒载体对细胞的毒性;用合成的纳米粒载体介导VEGFR-3siRNA转染LEPCs,荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效率;扫描电镜检测转染2h时纳米粒子与细胞的关系;透射电镜检测纳米粒于转染后2h和6h在细胞内的降解情况;RT-PCR和western-blot检测VEGFR-3siRNA的抑制效率。选取4～6周龄雌性Balb/c裸小鼠皮下接种S180细胞。将S180细胞按5×106个/200μl接种BABL/c裸小鼠建立肿瘤淋巴管新生模型。当肿瘤生长至20d时,将裸鼠随机分为3组:转染的LEPCs组(以5×105个/100μl转染的LEPCs直接瘤内多点注射,隔日1次,共2次)、未转染的LEPCs组(以5×105个/100μl的LEPCs直接瘤内多点注射,隔日1次,共2次)和对照组(瘤内未移植LEPCs)。于LEPCs移植后第2d和第4d处死动物取肿瘤组织,制作切片,荧光显微镜观察移植细胞的存活。于LEPCs移植后第21d处死动物取肿瘤组织,制作切片,采用LYVE-1免疫组化染色标记肿瘤淋巴管,在荧光显微镜下观察,参照Weidner法测定肿瘤组织内和周边的淋巴管密度。<br> 结果：人脐带血中VEGFR-3+细胞同时表达CD34和CD133。经VEGF-C诱导后1周,细胞CD133表达减弱;诱导后4周,细胞表达淋巴管内皮特异性标志物LYVE-1,CD133表达消失。扫描电镜和zeta电位仪检测结果显示,纳米粒载体表面电位为15～17.5mv,粒子直径为125～128nm,且多为球型结构。凝胶电泳阻滞分析结果表明,当N/P大于4时,PEI-alginate纳米粒对siRNA完全包封。MTT检测结果显示,经alginate修饰的PEI组在不同N/P时,对细胞的毒性均小于PEI转染组,且具有统计学意义。PEI-alginate纳米粒介导siRNA转染LEPCs后,N/P为8时,转染效率可达30％以上,明显高于对照组,P＜0.01。扫描电镜结果显示,在转染后2h,有纳米粒子吸附于细胞表面,在无血清的DMEM中,与PEI-alginate纳米粒相比,PEI-alginate/siRNA纳米粒表面光滑,粒径大于PEI-alginate纳米粒粒径,且两者粒径均大于在双蒸水中的粒径。透射电镜观察到,转染后2h,PEI-alginate/siRNA纳米粒已经进入细胞,且发生轻微降解,转染后6h,降解程度明显增强。RT-PCR和western-blot检测结果显示,转染后48h和72h,siRNA干扰组mRNA和蛋白表达水平明显减弱。各组裸鼠接种S180细胞9d后,在其接种部位长出肿块,成瘤率达90％,后呈进行性生长,至36d移植瘤直径约为1cm。肿瘤表面可见扩张的血管且与皮肤有粘连。荧光显微镜结果显示,移植组肿瘤组织可见到绿色荧光,提示移植细胞成功。LYVE-1免疫组织化学染色结果显示,与对照组相比,未转染的LEPCs组和转染的LEPCs组肿瘤内和肿瘤周边淋巴管显著增多。转染的LEPCs组与未转染的LEPCs组相比,肿瘤内和肿瘤周边淋巴管密度明显减少,具有统计学意义。<br> 结论：本研究制备了PEI-alginate纳米粒载体,此纳米粒载体成功介导VEGFR-3siRNA转染LEPCs,达到理想的转染效率和抑制效率。本研究建立了裸鼠S180肿瘤动物模型;PEI-alginate纳米粒介导VEGFR-3siRNA转染LEPCs可靶向抑制LEPCs向淋巴管内皮细胞分化,进而抑制肿瘤的淋巴管新生。这为临床深入研究抑制肿瘤淋巴管新生和以LEPCs为靶点治疗肿瘤提供了一定的理论参考和实验依据。
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