定量蛋白质组学作为蛋白质组学的重要组成部分，其为疾病诊断生物标志物的发现、筛选和验证提供了有效的手段。随着生物质谱技术的发展，相继被发展的各种基于质谱的相对定量方法为研究者们发现和筛选出了大量的潜在生物标志物，而绝对定量技术的发展则为潜在生物标志物的验证提供了手段。然而，这些定量方法都有其适用范围和局限性。因此，针对这些定量方法的局限性或具体的研究需要，本论文发展了一系列基于生物质谱技术的相对定量和绝对定量的新技术和新方法，包括二甲基标记技术与mTRAQ标记技术相结合(Triplex-QITL)实现用二级谱图中碎片离子进行定量的方法，其可以用于三组样品的同时相对定量;iTRAQ/mTRAQ标记技术与多反应监测(MRM)技术相结合（Hyperplex-MRM）实现四组样品中潜在生物标志物的同时绝对定量;18O标记技术与高分辨质谱相结合(Direct-S)实现血清样品中潜在生物标志物的绝对定量，该方法操作简单、血清样品不需要进行预先的高丰度蛋白去除或分馏。<br> 本论文由四部分组成，主要内容如下:<br> 第一章:介绍了定量蛋白质组学的发展现状，分为相对定量和绝对定量两个方面进行介绍，并介绍了各种定量蛋白质组学方法的原理、优缺点和发展应用，以及一些新出现的定量蛋白质组学方法。<br> 第二章:鉴于以前发展的终端标记技术一次只能比较两组样本，在本工作中我们发展了一种新型的三标等重标记的二级质谱定量方法(Triplex-QITL)，首先使用Lys-C酶进行蛋白酶解，产生C末端以赖氨酸(K)结尾的肽段，然后将二甲基标记的选择性标记用于肽段N末端的标记，然后再使用mTRAQ试剂对肽段C末端进行相应的标记。三标的二甲基标记和三标的mTRAQ标记通过一定的组合实现了三标的等重标记。首先使用标准肽段和标准蛋白对Triplex-QITL方法的定量准确性、动态范围、重现性进行了考察，然后使用细胞样品做了进一步的考察。另外，在我们发展的方法中，二级谱图(MS2)中不仅存在成对的b、y离子，也有来自于mTRAQ试剂的报告基团离子(113，117，121)和由于二甲基标记而信号强度增加的成对a1离子，这些不同的碎片离子均可以用于定量。我们对使用不同碎片离子进行定量均进行了分析，并对其做了比较。最后，我们将该方法成功用于了分析具有不同转移潜能的三株肝癌细胞的蛋白表达情况。<br> 第三章:传统的基于多反应监测技术（MRM）的定量方法，一次实验只能分析一组样本，为了增加分析的通量，我们发展了基于MRM技术的定量新方法（Hyperplex-MRM）。在该方法中，我们结合使用四标的iTRAQ试剂和mTRAQ试剂，使用mTRAQ试剂的轻标(△0)和重标(△8)标记标准肽段，四标的iTRAQ试剂分别标记四组不同的样本。因为四标的iTRAQ试剂和mTRAQ试剂的化学结构和元素组成是完全一样的，仅仅是13C和15N的个数不同，所以在MRM trace谱图上，iTRAQ标记的四组样本只呈现单一峰，且和mTRAQ标记的标准肽段同时出峰。因为加入的标准肽段的量是已知的，这样根据峰面积比值就可以计算得到四组不同样品中目标肽段的总量。另外，在MS2谱图中，根据iTRAQ试剂的报告离子峰的峰强度比值可以得到四组不同样本中目的肽段的相对比值。最后根据四组不同样品中目标肽段的总量和相对比值就可以得到目的肽段在每一个样本中的绝对含量。因此我们达到了绝对定量和相对定量的同时进行，在一次实验中可以定量到四组样本，另外，在该方法中我们还使用了双内标，增加了定量结果的可靠性。Ademosylhomocysteinase(AHCY)，cathepsin D(CTSD)，和lysozyme C(LYZ)与大肠癌的发展以及转移等有关，为了更好地对这几个蛋白进行定量验证，我们将发展的Hyperplex-MRM的方法成功地用于了这几个蛋白在大肠癌组织样本中的定量研究。<br> 第四章:在进行生物标志物的分析中，血清是最好的样品来源，但是目前对于血清中低丰度蛋白的直接分析还存在很大的挑战。在本工作中，我们发展了基于18O标记技术和高分辨质谱仪LTQ-Orbitrap的Direct-S方法，用于血清样品中目标蛋白的直接定量，从而实现对潜在蛋白标志物的验证。在实验中，血清样品不需要预先的去除高丰度蛋白或分馏等操作，而是直接进行酶解和质谱分析，从而减少样品的损失确保定量出的结果能准确反映目标蛋白在血清中的真实含量。在Direct-S方法中，18O标记技术用于稳定同位素标记的内标肽段的获得，该方法操作简单，成本低廉，且标记效率高;另外，我们使用固定化酶进行标记减少了回标现象的发生，使标记肽段具有很好的稳定性。在质谱检测时，只对所选择的目标肽段的母离子峰进行串级扫描，这样可以提高质谱检测的灵敏度，也节省了质谱扫描时间。针对不同浓度的蛋白，我们又制定了相应的不同准则确保对目标蛋白的准确定性和定量。Direct-S方法表现出了的较高的定量准确性，且在2～3个数量级范围表现出很好的线性，三次重复实验的结果很相近(RSD＜10％)。我们使用Direct-S方法对三个大肠癌潜在生物标志物(α1-antitrypsin(A1AT)、Galectin-3 binding protein(LG3BP)、Cathepsin D(CTSD)）进行了绝对定量。根据最终的定量结果，与正常人相比，A1AT在大肠癌样品中下调，而LG3BP和CTSD在大肠癌样品中上调，与以前的文献报告相符，这不仅证明了我们发展的Direct-S方法定量的准确性，也说明这几个蛋白确实与大肠癌的发生和发展相关。
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