HIF-1α基因转染联合骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的疗效及机制的研究  学位论文  

干细胞移植治疗心肌梗死是目前研究的热点。它在修复受损心肌,改善心功能方面有巨大潜力。但多项临床试验荟萃分析发现干细胞移植治疗改善心功能的效果并不能令人满意。近年来的研究显示联合干细胞移植和基因治疗能给病人带来更多的益处。本研究采用缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因转染联合骨髓间充质干细胞(MSCs)移植治疗心肌梗死,探讨基因治疗联合干细胞移植治疗的安全性和有效性。同时探讨HIF-1α基因治疗联合骨髓间充质干细胞移植治疗发挥作用的具体机制。本研究旨在探索使干细胞移植发挥最佳疗效的措施及机制。本研究发现HIF-1α基因腺病毒载体能有效地转染缺血心肌细胞,使心肌细胞高表达HIF-1α。HIF-1α能促进骨髓间充质干细胞归巢及在缺血心肌的存活,并促进缺血心肌毛细血管新生。术后4周HIF-1α基因转染联合骨髓间充质干细胞移植治疗组观察到MSCs分化为内皮细胞。术后4周HIF-1α基因转染联合骨髓间充质干细胞移植治疗组左室射血分数(LVEF)高于其他组。HIF-1α基因转染联合MSCs移植可能是通过增加HIF-1α的表达,从而促进SDF-1α,VEGF等细胞因子的表达,促进毛细血管新生,改善缺血心肌微环境,减少心肌细胞的凋亡,并促进干细胞归巢及其在缺血心肌的存活而发挥其保护心肌、改善心功能的作用。第一部分HIF-1α基因转染大鼠急性心肌梗死模型的实验研究目的：研究HIF-1α基因转染大鼠缺血心肌的效果,检测不同时间点HIF-1α mRNA及蛋白的表达情况。方法：27只SD大鼠随机分为3组,每组9只：(1)HIF-1α基因转染组：开胸结扎SD大鼠左冠状动脉前降支,制作大鼠心梗模型后经心外膜向心梗交界区心肌内注射HIF-1α-GFP腺病毒载体(Ad-HIF-1α-GFP)(6×109PFU)；(2)空白对照组：心梗后经心外膜向心梗交界区心肌内注射空质粒腺病毒载体(Ad-null-GFP)(6×109PFU).(3)假手术组：不结扎左前降支。术后1周荧光显微镜下观察心肌组织冰冻切片,评价HIF-1α基因转染心肌细胞情况。术后1周,2周,4周分批处死大鼠,real-time PCR、Western blot检测各组大鼠缺血心肌HIF-1αmRNA及蛋白的表达。结果：(1)术后1周荧光显微镜下观察心肌组织冰冻切片可见HIF-1α-GFP腺病毒载体成功转染大鼠缺血心肌细胞。(2)HIF-1α基因转染组和空白对照组术后1周,2周,4周HIF-1αmRNA的表达均呈递减趋势。(3)术后1周HIF-1α基因转染组的HIF-1αmRNA表达分别是空白对照组和假手术组的6.77倍和19.5倍；空白对照组HIF-1α的mRNA表达是假手术组的2.87倍,差异均有统计学意义(p<0.05)。(4)术后2周HIF-1α基因转染组的HIF-1αmRNA表达分别是空白对照组和假手术组的3.12倍和3.35倍,差异有统计学意义(p<0.05)。空白对照组和假手术组HIF-1αmRNA表达之间的差异无统计学意义(p>0.05)。(5)术后4周HIF-1α基因转染组的HIF-1αmRNA表达分别是空白对照组和假手术组的4.30倍和4.35倍,差异有统计学意义(p<0.05)。空白对照组和假手术组HIF-1α mRNA表达之间的差异无统计学意义(p>0.05)。(6)假手术组未检测到HIF-1α的蛋白表达。术后1周,2周,4周HIF-1α基因转染组和空白对照组的HIF-1α蛋白表达均呈递减趋势。(7)在术后1周,2周,4周3个时间点HIF-1α基因转染组HIF-1α的蛋白表达均明显高于空白对照组和假手术组。结论：(1) HIF-1α-GFP腺病毒载体能成功转染缺血心肌细胞。(2) HIF-1α基因转染组和空白对照组术后1周,2周,4周缺血心肌的HIF-1αmRNA和蛋白表达均呈递减趋势。(3)在术后1周,2周,4周3个时间点HIF-1α基因转染组HIF-la的mRNA和蛋白表达均明显高于空白对照组和假手术组。第二部分HIF-1α对骨髓间充质干细胞归巢及在缺血心肌中存活影响的研究目的：评价HIF-1α对骨髓间充质于细胞归巢及在缺血心肌中存活的影响。方法：分离、纯化、培养雄性SD大鼠MSCs,并用Dir荧光染料标记用于干细胞示踪。雌性SD大鼠20只,随机分为2组,每组各10只,两组大鼠随机两两配对：(1) HIF-1α基因转染联合MSCs移植治疗组：开胸结扎左冠状动脉前降支制作大鼠心梗模型,在心梗交界区分4点心肌内注射雄性大鼠MSCs (1X106个),同时分4点心肌内注射HIF-la腺病毒载体(Ad-HIF-1α) (6×109PFU); (2)单纯MSCs移植治疗组：心梗后将雄性大鼠MSCs(1×106个)分4点心肌内注射至心梗交界区,同时分4点心肌内注射空质粒腺病毒载体(Ad-null) (6× 109PFU)。大鼠在术前,术后3周行心超检查。术后1周,3周分批处死大鼠,用多模式小动物活体成像系统及实时定量PCR (real-time quantitative PCR)检测大鼠Y染色体雄性鉴别基因sry片段两种方法评价干细胞归巢及存活情况。结果：(1) 10μ g/ml Dir对MSCs的标记率达97±3%。(2)术前两组大鼠LVEF值之间的差异没有统计学意义(88.7±7.5%vs 87.4±7.4%,p>0.05)。术后3周HIF-la基因转染联合MSCs移植治疗组LVEF值高于单纯MSCs移植治疗组,差异有统计学意义(35.5±8.4%vs 29.8±7.6%,p<0.05)。(3)心肌组织冰冻切片观察到移植的MSCs主要分布在注射中心区,但有向周边区域迁移的趋势,术后3周在心梗区能观察到弥漫散在分布的MSCs。 (4)MSCs移植1周后,多模式小动物活体成像系统成像发现：HIF-1α+MSCs组光密度值高于单纯MSCs组,差异有统计学意义(8.34±0.81×1012 P/s/mm2 vs 7.63±0.82×1012 P/s/mm2,p<0.01).MSCs移植3周后,HIF-1α+MSCs组光密度值高于单纯MSCs组,差异有统计学意义(10.35±2.34×1012 P/s/mm2 vs 8.46±2.98×1012 P/s/mm2,p<0.05).(5)MSCs移植1周后,real-time quantitative PCR检测归巢至心脏并存活的MSCs:HIF-1α+MSCs组干细胞的存活率为7.4%,MSCs组为6.6%,两组差异有统计学意义(p<0.05)。MSCs移植3周后,HIF-1α+MSCs组干细胞的存活率为1.5%,MSCs组为0.7%,两组差异有统计学意义(p<0.01)。结论：(1)Dir能高效标记大鼠MSCs,进行干细胞示踪。(2)术后3周HIF-1α基因转染联合MSCs移植治疗组LVEF值高于单纯MSCs移植治疗组。(3)移植的MSCs能向周边区域迁移。(4)HIF-1α能提高MSCs归巢及在缺血心肌中的存活率。第三部分HIF-1α基因转染联合骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的疗效及机制的研究目的：评价HIF-1α基因转染联合骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的疗效及安全性,并探讨HIF-1α保护缺血心肌的具体机制。方法：SD大鼠随机分为5组,每组11只：(1)HIF-1α基因转染联合MSCs移植治疗组：开胸结扎左冠状动脉前降支制作大鼠心梗模型,心梗交界区分4点心肌内注射MSCs(1×106个),同时分4点心肌内注射HIF-1α腺病毒载体(6×109PFU):(2)HIF-1α基因转染组：心梗后注射HIF-1α腺病毒载体(6×109PFU)及等量细胞培养液(DMEM):(3)MSCs移植治疗组：心梗后注射MSCs(1×106个)及空质粒腺病毒载体(6×109PFU);(4)空白对照组：心梗后注射等量空质粒腺病毒载体(6×109PFU)和等量DMEM:(5)假手术组。大鼠在术后1周,2周,4周心超检查后分批处死,CD31抗体检测新生毛细血管密度,TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数(AI),并检测HIF-1α,SDF-1α,VEGF mRNA和蛋白的表达。大鼠处死后观察有无新发肿瘤,心肌组织有无过度炎症反应,评价HIF-1α基因转染联合MSCs移植治疗的安全性。结果：(1)术后1周心超检查显示HIF-1α +MSCs联合治疗组大鼠的LVEF值为37.18±10.07%,单纯HIF-1α转染组为35.57±6.82%,MSCs移植组为34.97±5.87%,空白对照组为32.16±5.05%。统计分析显示各组大鼠LVEF之间的差异无统计学意义(p>0.05)。术后2周HIF-1α +MSCs联合治疗组LVEF值为38.25±5.72%,单纯HIF-la转染组为32.94±7.38%,MSCs移植组为32.23±8.52%,空白对照组为30.72±3.19%。统计分析显示各组大鼠LVEF之间的差异无统计学意义(p>0.05)。术后4周HIF-1α+MSCs联合治疗组的LVEF值为40.96±8.91%,单纯HIF-1α转染组为30.99±9.00%,MSCs移植组为27.26±6.38%,空白对照组为25.87±5.58%。统计分析显示HIF-1α+MSCs联合治疗组LVEF值高于其他组(p<0.05)。单纯HIF-1α转染组,MSCs移植组和空白对照组LVEF值之间的差异没有统计学意义(p>0.05)。(2)术后4周HIF-1α+MSCs联合治疗组心肌组织冰冻切片观察到MSCs分化为内皮细胞。(3)术后4周在梗死交界区,HIF-1α+MSCs联合治疗组的新生毛细血管密度为1164±110个/mm2,HIF-1α转染组为1046± 120个/mm2, MSCs移植组为725±95个/mm2,空白对照组为592±97个/mm2,假手术组为166±27个／mm2。统计分析发现HIF-1α+MSCs联合治疗组的新生毛细血管密度高于其他各组,差异有统计学意义(与HIF-1α转染组相比,p<0.05,与其余组相比,p<0.01)。在梗死区,HIF-1α+MSCs联合治疗组新生毛细血管密度为978±114个/mm2,HIF-1α转染组为812±91个／mm2,MSCs移植组为573±82个/mm2,空白对照组为469±53个／mm2。HIF-1α+MSCs联合治疗组的新生毛细血管密度高于其他各组,差异有统计学意义(p<0.01)。(4)术后4周HIF-1α+MSCs联合治疗组的凋亡指数为9.1±2.4%,HIF-1α转染组为13.4±1.9%,MSCs移植组为15.6±2.3%,空白对照组为20.5±4.4%,假手术组为3.6±1.6%。HIF-1α +MSCs联合治疗组的凋亡率比MSCs移植组和空白对照组低,差异有统计学意义(与MSCs移植组相比p<0.05,与空白对照组相比p<0.01)。HIF-1α+MSCs联合治疗组的凋亡率与HIF-la转染组之间的差异没有统计学差异(p>0.05)。(5)术后1周,2周,4周HIF-1α+MSCs联合治疗组和HIF-1α转染组的HIF-1α, SDF-1α, VEGF mRNA和蛋白的表达均高于MSCs移植组、空白对照组和假手术组,差异有统计学意义(p<0.05). HIF-1α+MSCs联合治疗组与HIF-1α转染组之间的差异没有统计学差异(p>0.05)。(6)实验动物未发现有新发肿瘤,心肌组织未发现有过度炎症反应。结论：HIF-1α基因转染联合MSCs移植是治疗心肌梗死的一种安全有效的治疗方法。HIF-1α可能通过增加SDF-1α, VEGF等细胞因子的表达,促进毛细血管新生,改善缺血心肌微环境,减少心肌细胞的凋亡,并促进干细胞归巢及其在缺血心肌的存活发挥其保护心肌,改善心功能的作用。