SATB1对人乳腺癌多药耐药的影响及相关机制的研究  学位论文  

前言 化疗作为乳腺癌手术治疗的重要辅助手段,是利用化疗药物杀死肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞生长繁殖而发挥治疗作用的。但临床数据和实验结果显示,化疗并不是对每个乳腺癌患者都能起到预防复发和转移的效果。原因是有些乳腺癌细胞与生具有对化疗药物的抵抗性,即原发耐药；而另一些本来对药物敏感的乳腺癌,在某些先期化疗药物的诱导下,出现了对多种不同分子结构和作用机理的药物同时具有耐药性,即继发耐药,也称多药耐药(multidrug resistance, MDR)。多药耐药基因MDR1编码的蛋白P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp),是一类分子量为170kD,依赖ATP供能的跨膜转运分子,能把抗肿瘤药物从细胞内泵至细胞外,降低胞内药物浓度从而表现出对药物的不敏感,是经典多药耐药的分子机制,肿瘤细胞中MDR1的表达涉及到复杂的多因素相互作用。多药耐药还涉及到肿瘤细胞对凋亡刺激因子的抑制作用,以及肿瘤细胞获得干细胞特性而逃避化疗药物的杀伤作用。 富AT序列特异性结合蛋白1(Special AT-rich sequence binding protein1, SATB1)是一种组织特异性的核基质结合区(matrix attachment regions, MARs)结合蛋白,扮演基因组织者(genome organizer)的角色,通过重塑染色体的空间结构而改变基因的表达,使乳腺癌细胞获得侵袭性表型,促进乳腺癌浸润转移,SATB1与乳腺癌的生长、转移及预后关系密切。 我们的前期工作结果显示在乳腺癌中肿瘤的侵袭能力和多药耐药存在着功能联系,但对于决定乳腺癌侵袭性的SATB1是否也影响到乳腺癌的多药耐药尚无报道,本研究目的是探讨SATB1和MDR之间的关系及其分子机制。 第一部分SATB1在乳腺癌细胞中的表达与多药耐药的关系 目的观察SATB1与人乳腺癌细胞多药耐药表型的关系,为后续研究奠定基础。 方法用real-time PCR和western blot方法检测乳腺癌药物敏感株MCF7细胞和耐药株MCF7/ADR细胞中SATB1在基因转录和蛋白表达水平的差异；western blot检测药物敏感株细胞MCF7、Hs578T、MX-1及其对应耐药株细胞MCF7/MX、 Hs578T/DOX、MX-1/T中,以及不同浓度阿霉素诱导的MCF7细胞株耐药亚型中SATB1的蛋白表达；采用pEGFP-N1-SATB1-GFP真核表达质粒瞬时转染MCF7细胞和SATB1-siRNA干扰MCF7/ADR细胞,用MTT法检测阿霉素对MCF7/ADR细胞经干扰前后相对抑制率的改变；把经SATB1转染和干扰前后的乳腺癌细胞接种裸鼠,然后通过尾静脉注射阿霉素,以肿瘤大小代表相对生长率来评估体内阿霉素对肿瘤细胞的抑制作用。 结果乳腺癌耐药细胞株MCF7/ADR中SATB1的量在mRNA和蛋白水平均高于药物敏感乳腺癌细胞株MCF7；药物敏感细胞株MCF7、Hs578T、MX-1中SATB1蛋白表达低于其对应耐药株细胞MCF7/mitoxantrone(MCF7/MX)、Hs578T/doxorubicin (Hs578T/DOX)、MX/Taxol(MX-1/T);在诱导MCF7细胞耐药亚型过程中SATB1的表达水平随着阿霉素量的增大而升高；阿霉素对MCF7/ADR-SATB1RNAi细胞的相对抑制率明显高于对照组MCF7/ADR细胞；阿霉素对裸鼠体内的MCF7-con和MCF7/ADR-SATB1RNAi细胞表现出比MCF7-SATB1和MCF/ADR-con细胞更强的抑制作用。 小结SATB1与人乳腺癌细胞多药耐药表型有着密切的关系。 第二部分P-gp在SATB1相关乳腺癌多药耐药中的作用 目的探讨SATB1对乳腺癌跨膜转运蛋白介导的多药耐药的调节作用及其分子机制。 方法采用pEGFP-N1-SATB1-GFP真核表达质粒瞬时转染MCF7细胞和SATB1-siRNA干扰MCF7/ADR细胞采用, western blot检测处理前后各细胞中P-gp、乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistant protein, BCRP),多药耐药蛋白(multidrugresistant protein, MRP)1在蛋白水平的表达；定量RT-PCR检测个细胞中MDRl基因的转录水平；MTT法检测各细胞对P-gp底物类及非P-gp底物类药物的敏感性；用激光计数法检测各细胞内阿霉素的沉积评估药物泵功能；用P-gp单抗处理MCF7-SATB1, MTT检测其对化疗药ADM和MTX敏感性的变化；用免疫组化法检测临床乳腺癌标本中SATB1和P-gp表达的相关性。 结果在MCF7-SATB1和MCF7/ADR-con细胞中P-gp的表达高于MCF7-con和MCF7/ADR-SATB1RNAi细胞,而MRP1和BCRP则无明显改变。MCF7-SATB1和MCF7/ADR-con细胞中MDR1mRNA的量高于MCF7-con和MCF7/ADR-SATB1RNAi细胞。MCF7经SATB1转染后,对P-gp相关类药物的抵抗性有明显的升高,对非P-gp相关类药物则略有升高,而MCF7/ADR经SATB1-siRNA干扰后则表现出对P-gp底物类药物的敏感性增加和对非P-gp底物类药物敏感性的选择性升高；用阿霉素孵育时发现MCF7-SATB1和MCF7/ADR-con细胞内的阿霉素浓度均分别低于MCF7-con和MCF7/ADR-SATB1RNAi细胞；P-gp单抗可以部分逆转SATB1转染MCF7细胞所致的对P-gp底物类药ADM的抵抗作用,但不能逆转对非P-gp底物类药MTX的抵抗作用；在临床乳腺癌标本中SATB1的表达和P-gp的表达是平行的。 小结SATB1通过上调P-gp的表达而增强乳腺癌的多药耐药功能。 第三部分SATB1对乳腺癌干细胞表型CD44+/CD24-的影响及SATB1在乳腺癌抗阿霉素所致凋亡中的作用 目的探讨SATB1在乳腺癌肿瘤干细胞及抗凋亡所致耐药中的作用及机制。 方法采用SATB1-siRNA双链寡核糖核酸干扰MCF7/ADR、MDA-MB-231细胞,采用pEGFP-N1-SATB1-GFP真核表达质粒瞬时转染MCF7细胞,用流式细胞术检测MCF7、MDA-MB-231细胞经SATB1转染、干扰前后乳腺癌干细胞表型CD44+/CD24-的表达；阿霉素处理MCF7、MCF7/ADR及MCF7-SATB1、 MDA-MB-231-SATB1RNAi, western blot检测SATB1的表达,了解其裂解状态,流式细胞术及Casepase活性检测术定量分析阿霉素所致乳腺癌细胞的凋亡。 结果MCF7细胞经SATB1转染后,CD44+/CD24-比例明显升高；MDA-MB-231细胞经SATB1-siRNA干扰后,CD44+/CD24-比例明显降低。MCF7/ADR-SATB1RNAi细胞经阿霉素处理后出现了SATB1的裂解,接着进入程序性死亡；阿霉素诱导的caspase活性在异位表达SATB1的MCF7细胞中明显的下降了,而在敲除了SATB1的MCF7/ADR细胞中则明显的升高了。 小结SATB1可能在形成和维持乳腺癌干细胞特性中起作用；SATB1增强了乳腺癌细胞抗药物诱导凋亡的能力。