银杏酮酯对周围神经再生影响的实验研究  学位论文  

引言：周围神经损伤后促进神经再生是一大难题，其主要原因之一是缺乏促进神经再生的有效措施或有效药物。目前尽管已进行了不少研究，如电刺激、神经生长因子、中药等。虽然有一定作用，但效果仍不能令人满意。因此进一步研究经济、有效、使用方便的促进神经再生药物，仍是有待急需解决的重要课题。银杏叶作为我国传统药物，其提取物近几年来广泛用于脑部疾患和心血管疾病的治疗。已有研究表明银杏叶提取物有助于周围神经再生，但有关其作用机制的研究不多。本研究的目的就是要进一步证实新一代银杏叶提取物银杏酮酯(EGb_(50))促进周围神经再生的有效性，确定不同剂量药物的作用强度，并阐明其可能的作用机制。本研究共分以下三个部分： 第一部分：银杏酮酯对大鼠坐骨神经再生的影响及其量效关系 目的：评价银杏酮酯(EGb_(50))对大鼠坐骨神经损伤后神经再生的影响及其量效关系。方法：雄性SD大鼠150只随机分为5组：损伤对照组(A组)、银杏酮酯低剂量组(B组)、银杏酮酯中剂量组(C组)、银杏酮酯高剂量组(D组)和神肌再生冲剂组(E组)。距梨状肌下缘0.8cm处切断坐骨神经，立即在手术显微镜下以11-0无创尼龙针线缝合。术后A组每天给予生理盐水1ml灌胃，B、C、D组分别给予EGb_(50)50mg·kg~(-1)·d~(-1)、100mg·kg~(-1)·d~(-1)、200mg·kg~(-1)·d~(-1)用生理盐水稀释成1ml灌胃，E组给予神肌再生冲剂浓缩液1ml灌胃。术后1周行感觉神经再生距离检测，术后2、4、6、8周用电生理学、组织学和功能测定评估坐骨神经再生和功能恢复情况。结果：(1)感觉神经再生距离：B、C、D、E组明显大于A组，D组感觉神经再生距离大于B、C、E组，其差异有统计学意义(P＜0.01)。B、C、E组之间的差异无统计学意义(P＞0.05)。(2)坐骨神经功能指数(SFI)：B、C、D、E组在术后各时间点SFI均明显优于A组，差异有统计学意义(P＜0.01)。但是B、C、D、E组之间的差异无统计学意义(P＞0.05)。(3)小腿三头肌肌张力：除B组术后2周强直收缩力恢复率和A组之间的差异无统计学意义(P＞0.05)，B、C、D、E组各时间点小腿三头肌单纯肌张力和强直收缩力恢复率均优于A组，差异有统计学意义(P＜0.01)。D组单纯肌张力和强直收缩力恢复率优于B、C组(P＜0.05)，B、C组之间的差异无统计学意义(P＞0.05)。术后2周，E组单纯肌张力恢复率优于B组(P＜0.05)，但差于D组(P＜0.01)，和C组之间的差异无统计学意义(P＞0.05)。术后4、8周，E组单纯肌张力恢复率优于B组(P＜0.05)，和D组无明显差别(P＞0.05)。术后6周，E组和B、C、D组之间的差异无统计学意义(P＞0.05)。术后2周，E组强直收缩力的恢复率优于B、C组(P＜0.05)，和D组之间的差异无统计学意义(P＞0.05)。术后4周，E组强直收缩力的恢复率优于B组(P＜0.05)，和C、D组之间的差异无统计学意义(P＞0.05)。术后6、8周，E组强直收缩力的恢复率和B、C、D组之间的差异无统计学意义(P＞0.05)。(4)电生理学检测：B、C、D、E组在术后各时间点的运动神经传导速度及诱发电位波幅恢复率均优于A组(P＜0.01)。B、C、D组间两两相比差异均有统计学意义(P＜0.05)。术后2周，E组运动神经传导速度及诱发电位波幅恢复率均优于B、C组(P＜0.05)，和D组的差别无统计学意义(P＞0.05)。术后4周E组优于B组(P＜0.05)，和C、D组的差别无统计学意义(P＞0.05)。术后6、8周，E组优于B组(P＜0.05)，但差于D组(P＜0.05)，和C组的差别无统计学意义(P＞0.05)。(5)小腿三头肌湿重恢复率：B、C、D、E组在术后各时间点的肌肉湿重恢复率均优于A组(P＜0.01)。D组肌肉湿重恢复率优于B、C组(P＜0.05)，B、C组之间的差异无统计学意义(P＞0.05)。术后2、6、8周，E组和B、C、D各组之间的差异无统计学意义(P＞0.05)。术后4周，E组优于B组(P＜0.01)，和C、D组之间的差异无统计学意义(P＞0.05)。(6)小腿三头肌肌细胞截面积恢复率：术后2、4、6、8周A组均明显低于B、C、D、E组，差异有统计学意义(P＜0.01)。D组优于B、C组(P＜0.05)。B、C组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。E组肌细胞截面积恢复率大于B、C组(P＜0.05)，和D组无明显差别(P＞0.05)。(7)有髓神经纤维通过率：B、C、D、E组各时间点有髓神经纤维通过率均明显优于A组，差异有统计学意义(P＜0.01)。D组和B、C组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。B、C组相比，2、6周组差别无统计学意义(P＞0.05)，4、8周组差异有统计学意义(P＜0.01)。术后2、4周E组有髓神经纤维通过率和B、C、D组之间的差异无统计学意义(P＞0.05)，术后6周E组优于B、C组(P＜0.01)，和D组无明显差别(P＞0.05)。术后8周，E组优于B、C、D组(P＜0.05)。结论：银杏酮酯可以促进损伤神经的再生，且对神经再生的促进作用存在一定的量效关系，其中200mg·kg~(-1)·d~(-1)的银杏酮酯对大鼠坐骨神经再生的促进作用较好。 第二部分：银杏酮酯促进雪旺细胞增殖的实验研究 目的：观察银杏酮酯(EGb_(50))对体外培养的乳鼠雪旺细胞增殖的影响，探讨其促进神经再生的作用机制。方法：将纯化的雪旺细胞按5×10~4／ml的浓度接种至96孔板，随机分为实验组和对照组，实验组加含终浓度为50ug／ml银杏酮酯的DMEM培养液培养，对照组培养液中不加银杏酮酯。施加处理因素后第1、3、5、7、9d，每组各取6孔细胞，用XTT法检测不同时间点的吸光度(OD)值并绘制生长曲线。另在培养第48、72小时后用3H-胸腺嘧啶核甙测定法检测每分钟射线绝对衰变数(DPM)。结果：施加处理因素后第1、3、5、7、9d，XTT法检测所得实验组的OD值分别为0.49±0.01、0.56±0.03、0.86±0.02、0.90±0.06、0.92±0.03，对照组的OD值分别为0.36±0.01、0.42±0.03、0.59±0.15、0.60±0.15、0.61±0.14。不同时间点的OD值实验组均高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)；接种后48h和72h，3H-胸腺嘧啶核甙检测DPM值实验组也高于对照组，实验组为961.78±231.13、4601.51±605.08，对照组为1347.15±121.57、3740.42±158.73，差异有统计学意义(P＜0.01)。结论：银杏酮酯有促进雪旺细胞分裂增殖的作用，可能是其促进周围神经再生的重要机制之一。 第三部分：银杏酮酯对大鼠坐骨神经损伤后神经生长因子、生长相关蛋白-43及诱导型一氧化氮合酶表达的影响 目的：观察银杏酮酯对大鼠坐骨神经损伤后神经组织、脊神经节和脊髓中神经生长因子(NGF)、生长相关蛋白(GAP-43)及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响，探讨其促进周围神经再生的作用机制。方法：SD大鼠156只，随机分成正常组、损伤对照组与实验组，后两组切断右侧坐骨神经并缝合。实验组给予EGb_(50)200mg·kg~(-1)·d~(-1)用生理盐水稀释成1ml灌胃，对照组给予生理盐水1ml灌胃，正常组不作处理。分别于术后1、3、7、14、21及28d取吻合口远端的神经及坐骨神经相应的脊髓节段(L4～L6)和脊神经节(L5、L6)，采用免疫组化和实时定量PCR技术检测所取组织中NGF、GAP-43及iNOS的表达水平。结果：1．NGF：神经损伤后，远侧段神经组织、脊神经节和脊髓中NGFmRNA及其蛋白表达均有不同程度的增加，远侧段神经组织中实验组在术后7、14和21d NGF mRNA表达高于对照组，在术后7、14、21和28d NGF免疫阳性区域面积及平均光密度值高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。术后7d和14d实验组脊神经节和脊髓组织中NGF mRNA表达高于对照组，术后7、14、21和28d NGF免疫阳性区域面积及平均光密度值高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。2．GAP-43：大鼠坐骨神经损伤后，远侧段神经组织、脊髓和脊神经节GAP-43mRNA及其蛋白表达明显增加，实验组在术后7、14d GAP-43mRNA表达高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。术后7、14和21d实验组的GAP-43免疫阳性区域面积及平均光密度值高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。3．iNOS：正常坐骨神经、脊神经节和脊髓中未见iNOS mRNA明显表达。坐骨神经损伤后，实验组和损伤对照组脊神经节和脊髓组织中iNOSmRNA表达均有不同程度的增加。术后1、3和7d，实验组坐骨神经中iNOS mRNA的表达低于对照组(P＜0.01)。实验组坐骨神经中iNOS免疫阳性区域面积及平均光密度值在术后3、7、14和21d明显低于对照组(P＜0.05)。术后7天实验组脊神经节和脊髓组织中iNOS mRNA表达高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。术后7、14d，脊神经节组织中平均光密度值低于对照组。术后7d，脊神经节组织iNOS免疫阳性区域面积低于对照组。术后7d，脊髓组织中iNOS免疫阳性区域面积及平均光密度低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论：大鼠坐骨神经损伤后应用银杏酮酯，在早期可增加吻合口远端的神经及相应的脊髓节段和脊神经节中NGF、GAP-43的表达，可抑制iNOS的表达。