目的：端粒酶可以维持端粒体长度,防止细胞衰老,在胚胎干细胞中高度表达,但除部分成体干细胞(如造血干细胞)外,成年体细胞内几乎已无端粒酶的表达。我们利用已报道的端粒酶基因启动的GFP转基因鼠(mTert-GFP)研究端粒酶阳性细胞在肾脏的表达和肾损伤后变化,并求证端粒酶阳性表达能否成为肾脏成体干细胞的标志,进一步明确急性肾损伤修复的机制,以寻求指导急性肾损伤治疗的理论基础。 方法：(一)利用mTert-GFP转基因小鼠,通过肾小管标记物(AQP1、AQP2、THP、DBA及NKCC2等)和肾间质细胞标志物(F4/80、CD31、NG2及PDGFR-beta等)荧光共染定位端粒酶阳性细胞(GFP+)；通过real-time PCR和TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol) PCR Elisa定量检测端粒酶基因和酶活性；(二)给新生mTert-GFP小鼠腹腔注射BrdU标记S期细胞,待8周成年后处死,仍保留BrdU标记的细胞为进入缓慢细胞周期的细胞Label-retaining Cells (LRC),观察并计数；(三)10周龄雄性FVB小鼠24只,夹闭双侧肾动脉30min,再通,制作小鼠双侧肾动脉缺血再灌注损伤(I/R)模型,分为假手术组(sham)、术后1天、2天、3天共4组,每组6只,分别取肾标本,同样用PCR和TRAP法检测肾损伤修复过程中端粒酶基因和酶活性的变化；(四)利用mTert-GFP转基因小鼠,建立单侧肾脏I/R模型,并在术后肾损伤再修复过程中不同时间点观察mTert-GFP再生情况；(五)利用mTert-CreERt2; R26LacZ两种转基因小鼠,通过谱系追踪和细胞周期标记研究肾缺血再灌注损伤修复过程中mTert细胞的再生和迁移。 结果：(一)生理状态下,端粒酶基因主要表达在成年小鼠肾脏乳头和内髓部位,保持较高的酶活性。成年mTert-GFP转基因小鼠的肾脏mTert表达与GFP保持一致,端粒酶主要表达于集合管和髓袢的小管上皮细胞(即AQP1、AQP2、THP、NKCC2阳性的小管),而在近曲小管和间质没有表达。(二)观察BrdU标记的肾乳头,16.7%的细胞长期保留BrdU标记,仅5%GFP+细胞仍有BrdU标记,视为进入慢细胞周期的LRC,这些细胞也散在分布于集合管和髓袢。(三)mTert基因于肾损伤后48h在肾乳头的表达明显上调,有统计学意义(P<0.05),但在髓质和皮质的表达无显著变化。双侧肾损伤后24h和48h,肾乳头处端粒酶活性也显著升高,有统计学意义(P<0.05)。(四)为证明急性肾损伤后端粒酶阳性细胞的作用,IRI刺激后24h、48h和72h分别给予BrdU,发现仅0.3%-0.5%的GFP+细胞增殖,且损伤最严重的外髓和皮质未出现GFP+细胞显著增加。(五)为追踪mTert+上皮细胞在工/R后的命运,术前一周给成年mTert-CreERt2; R26LacZ鼠单剂tamoxifen,术后连续5天给予BrdU,发现mTert-LacZ细胞未出现明显增殖和迁移,mTert+细胞也并未标记BrdU。 结论：本研究首次报道了端粒酶在成年小鼠肾脏中的表达主要集中于肾乳头和内髓,定位于肾脏集合管和髓袢上皮细胞。在急性肾损伤时端粒酶活性和基因表达均上调,可能对肾脏有保护作用,但表达端粒酶的细胞并未明显增生,参与损伤后修复。
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