目的：Atohl/Math 1基因诱导耳蜗原位及异位毛细胞再生已经得到体内及体外实验证实,抑制Notch信号通路可以诱导新生鼠及胚胎额外毛细胞再生,但Notch信号通路与Atohl共同作用于新霉素处理后的感觉上皮诱导毛细胞再生的效果尚无研究。Atohl表达水平决定内外毛细胞发育、成熟,但是否同样决定异位毛细胞样细胞发育成熟未得到证实。且异位新生毛细胞样细胞是否会类似发育中的内外毛细胞发生汇聚伸展现象,又与哪些调控因素有关未见文献报道。因此,本研究拟解决如下问题：1) Atohl过表达及Notch通路抑制剂DAPT单独或联合作用新霉素处理后的大鼠基底膜,观察原位区域毛细胞样细胞是否具有差异；2)不同滴度的Ad5-EGFP-Atohl作用于体外培养的基底膜,观察小上皮脊异位毛细胞样细胞的数目变化及纤毛发育、成熟。3) Ad5-EGFP-Atohl诱导产生的异位毛细胞样细胞是否具有汇聚伸展现象及其影响因素。方法：本研究以体外培养耳蜗基底膜诱导毛细胞再生为模型。1)取耳蜗中圈基底膜体外培养,新霉素处理后,不同浓度胎牛血清共培养,然后行Ad5-EGFP-Atohl/Ad5-EGFP转染, 取耳蜗感觉上皮高效转染的基底膜进行Notch信号通路阻滞剂培养,转染8天后沿耳蜗感觉上皮区域长轴方向计数200um范围内Myosin7a阳性细胞数目。并利用激光共聚焦和T检验从形态学和统计学角度验证和分析抑制Notch信号通路对Atoh1诱导的原位区域毛细胞再生的调控作用。2)分别使用0.16×108,0.4×108,0.8×108,1.6×108,2.4×108 PFU/mlAd5-EGFP-Atoh1转染培养的中圈基底膜,对病毒转染后不同时间点的标本进行固定和免疫组织化学染色,计数不同滴度的病毒组不同时间点小上皮脊非感觉上皮异位新生毛细胞样细胞的数目,并观察异位新生毛细胞样细胞形态变化及纤毛变化。3)观察不同病毒组不同时间点小上皮脊最外侧异位新生毛细胞样细胞至感觉区域的距离变化及异位新生毛细胞样细胞之间的间距变化,评估异位异位新生毛细胞样细胞是否具有群体汇聚伸展现象,并分析相关调控因素。结果：1)、①新霉素处理的基底膜经10%血清培养48h后,支持细胞间距明显变大,感觉上皮Atohl转染效率增加。②Atoh1过表达于耳蜗感觉上皮后感觉区域新生毛细胞样细胞生成。③Notch通路抑制剂DAPT与Atohl共同作用于耳蜗感觉上皮,原位区域毛细胞样细胞数目明显增多。EGFP对照组、DAPT、DMSO单独作用于耳蜗感觉上皮无新生毛细胞样细胞生成。 2)、①梯度为0.16×108,0.4x10* , 0.8xlO8 , 1.6x10* PFU/ml的腺病毒转染基底膜24小时后,小上皮脊区域转染效率随浓度上升逐渐增加。2.4xlO8 PFU/ml组基底膜组织破坏、细胞离断。? 0.16xl08 PFU/ml组在不同的时间点均未观察到异位毛细胞样细胞。0.4x10*, 0.8x10*, 1.6x10* PFU/ml组小上皮脊区域异位新生毛细胞样细胞数目随病毒滴度增加而增加,随Atohl作用时间增加而增加。③Atohl表达水平高的非感觉细胞短时间内快速变为异位新生毛细胞样细胞,表达水平低的细胞逐渐变为异位新生毛细胞样细胞,Atohl表达水平过低的细胞无法转变为毛细胞样细胞,部分未能成功转变为异位新生毛细胞样细胞的非感觉细胞部分逐渐转变为感觉前体细胞。?O.lxiO8 -1.6x10* PFU/ml浓度范围内, 异位新生毛细胞样细胞纤毛形态随Atohl表达水平增加、作用时间延长而逐渐发育、成熟,形态近似于V字型。3X (DAtohl诱导的异位新生毛细胞样细胞可自发发生群体汇聚迁移运动,最外侧细胞逐渐、缓慢向Corti"s区域迁移运动,最终与内外毛细胞融合为一体,对照组小上皮脊细胞未观察到动态改变。? 0.4x10*-1.6x10* PFU/ml浓度范围内,异位新生毛细胞样细胞群体汇聚迁移速度随Atohl表达水平及作用时间增加而增加。③异位新生毛细胞样细胞表面细胞粘附蛋白E-cadherin表达水平高,对照组的表达低。结论： 1)、①新霉素与血清共同作用提高感觉上皮腺病毒转染效率。(2) Atohl过表达诱导感觉上皮区域新生毛细胞样细胞再生。Notch通路抑制剂促进Atohl诱导的耳蜗感觉上皮区域毛细胞再生作用。2)、①病毒转染滴度不同,小上皮脊非感觉细胞转染效率不同。(DAtohl过表达水平越高,作用时间越长,异位新生毛细胞样细胞数目越多、纤毛形态越成熟。3)、异位新生毛细胞样细胞具有群体自发性汇聚迁移现象,且与Atohl表达量及作用时间有关。
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