先天性肛门直肠畸形(anorectal malformations, ARM)是小儿最常见的消化道重大畸形,是世界卫生组织常规监测的先天畸形之一,我国发病率约为2.81/10000。虽然通过外科手术治疗能够纠治形态上的畸形,但有相当部分患儿,尤其是中、高位畸形患儿,术后仍然存在不同程度的排便功能障碍如便失禁、污粪、便秘等,发生率高,直接影响着患儿术后的生活质量。由于先天性ARM发病因素多样及病理改变复杂,其具体病因及胚胎形成机制至今尚未完全阐明。目前普遍认为可能在妊娠期,特别是在妊娠早期肛门直肠发育的关键时期受外界因素如病毒感染、化学物质、环境及营养因素等干扰引起宫内环境不良而导致发育异常。为进一步阐明该病的发病机制,本研究借助全因组甲基化芯片及生物信息学技术对ARM患儿末端直肠组织全基因组甲基化状态进行研究；并对胚胎发育分化密切相关基因SHH在ARM中的甲基化状态和转录水平表达情况进行验证,旨在进一步阐明表观遗传学调控机制在ARM发病中的可能作用,以求为寻找有效的预防和治疗手段提供理论依据。 第一部分先天性肛门直肠畸形患儿末端直肠全基因组甲基化状态 目的利用全基因组甲基化芯片技术及生物信息学方法对先天性肛门直肠畸形患儿末端直肠组织的全基因组甲基化状态进行研究,筛选差异甲基化位点及基因,以进一步阐明该病的发病机制。 方法收集先天性肛门直肠畸形患儿(高位畸形5例,中位畸形5例,低位畸形10例)和非胃肠道畸形患儿(6例,均为我院诊断并行手术治疗的肛瘘)的末端直肠组织。分组原则：分为中高位组、低位组和对照组,将同组病例的组织标本混合检测一张芯片,力图使组间差异最大而组内差异最小。采用人类全基因组甲基化芯片(450K Infinium Methylation BeadChip)对全基因组中大于450000的CpG岛或CpG位点进行差异甲基化分析。每个CpG位点设计两个探针：甲基化和去甲基化探针。对所得差异基因甲基化位点进行校正方法及差异分析。 结果在先天性肛门直肠畸形患儿末端直肠组织全基因组DNA中共筛选出32731个差异甲基化位点,其中15141个发生低甲基化,17590个发生高甲基化。我们根据基因的功能不同,再进一步增加限定条件后,发现部分发育分化相关基因高甲基化占有优势,如SHH、Wnt5a、Fgf10、Cdx1等 结论先天性肛门直肠畸形患儿末端直肠标本全基因组中部分发育分化相关基因相对高甲基化占有优势,如Wnt5a、Fgf10、Cdx1等均处于高甲基化状态。而与人类胚胎发育,尤其是肛门直肠和肠神经系统(Entric nervous system, ENS)的发育密切相关的SHH基因亦处于高甲基化状态。 第二部分先天性肛门直肠畸形患儿末端直肠SHH基因启动子区的甲基化状态及转录水平表达 目的研究先天性肛门直肠畸形患儿末端直肠组织中发育分化密切相关基因SHH启动子区的甲基化状态,并观察其转录水平表达情况。 方法选取20例肛门直肠畸形(高位5例,中位5例,低位10例)及6例非胃肠道畸形对照组进行对比研究；分为中高位组、低位组和对照组。术中留取末端直肠组织,提取组织的DNA和RNA；实时定量逆转录聚合酶链反应(Real-time RT-PCR)检测SHH的mRNA表达水平。亚硫酸氢钠-测序法检测SHH启动子区DNA甲基化水平。 结果与对照组相比,中高位组和低位组中SHH启动子区平均甲基化程度明显增高(p值分别为0.0036和0.0087),转录水平表达明显减低(p分别为0.0065和0.0156)；中高位组相对于低位组,SHH启动子区平均甲基化程度亦明显增高(p=0.0095),转录水平表达明显减低(p=0.0252)。SHH基因启动子区甲基化水平与其转录水平表达呈负相关(r=-0.89,p<0.05)。 结论先天性肛门直肠畸形中,SHH基因启动子区处于高甲基化状态,并且调控转录水平低表达,此表观遗传学调控机制可能在先天性肛门直肠畸形发病起着重要作用。
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