目的:通过本研究对上海HIV-1分离株vif基因及蛋白的结构深入了解;体外重组HIV-1Vif蛋白、制备Vif的鼠多克隆抗体并构建Vif慢病毒载体感染细胞模型为进一步研究利用RNAi技术干扰Vif表达,论证以Vif入手进行HIV-1干预的基因治疗可行性。研究方法:利用RT-PCR法体外扩增上海HIV-1分离株vif基因,通过测序并与国际标准HIV-1分离株比较分析上海HIV-1分离株vif基因的突变率,并导出氨基酸变异情况;进一步构建vif基因pET32b(+)原核表达载体,利用BL21 star(DE3)(pLysS)细胞系表达并纯化Vif蛋白,以纯化的Vif蛋白免疫小鼠制备其鼠多克隆抗体,以ELISA法检测重组的Vif蛋白及其多克隆抗体的功能;构建HIV-1Vif慢病毒表达载体,感染HEK293T细胞及正常人PBMC细胞,并以Real-Time PCR法和SDS-PAGE检测vif基因和Vif蛋白的表达。结果:本研究数据证实上海HIV-1分离株vif基因与国际标准HIV毒株比较存在较高突变率,但在150bp～245bp(579bp)之间存在有相对保守的碱基序列,Vif蛋白的氨基酸存在一定的变异规律,这些氨基酸变异位点是否影响Vif的功能还不十分清楚,有待于进一步研究:本研究重组、表达的HIV-1Vif蛋白,并成功制备了其多克隆抗体,并通过实验证实AIDS患者血清标本中不存在或仅存在少量的HIV-1Vif抗体,在HIV-1感染者体内的检测价值还可以进一步研究;本研究成功构建了表达Vif蛋白的慢病毒载体感染正常人PBMC细胞模型及HEK293T细胞模型。结论:基于HIV-1Vif在HIV-1发病过程中的重要性,对其基因及蛋白的深入研究,能够找到HIV感染/AIDS基因治疗的新手段,本研究对HIV-1vif基因序列的研究,找到相对保守的序列供RNAi作用靶序列选择;制备的Vif鼠多克隆抗体可用于Vif蛋白的检测;同时构建了Vif干扰细胞模型,可用于进一步的深入研究。
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