石杉碱甲对衰老小鼠肝脏胰岛素信号通路与氧化应激-炎症的作用机制研究  学位论文  

[背景]随着人们生活水平的提高,人口老龄化逐渐加速,衰老相关疾病已成为威胁人类健康的主要敌人。因此,对衰老机制及衰老相关疾病的研究越发重要,近年来得到广泛的重视和关注。目前衰老的确切机制尚不清楚。衰老进程的一个主要特征是促炎-抗炎反应失衡,促炎症反应状态慢性进行性升高,导致慢性低度炎性状态,有研究表明胰岛素抵抗也是一个慢性炎症过程,且随年龄上升胰岛素抵抗发生率增加。石杉碱甲是一种可逆的、选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂(AChEI),目前国内临床广泛应用于神经退行性疾病的治疗,如阿尔茨海默病。然而,关于石杉碱甲能否影响衰老肝脏的胰岛素信号通路及氧化应激-炎症,目前的研究不多。胰岛素是机体重要的细胞内生长因子,可通过胰岛素受体底物(IRS),调节下游的PI3K/Akt/FOXO/NF-κB信号通路,参与氧化应激-炎症及衰老的调控。同时,炎症和衰老又可以反过来影响胰岛素信号转导,这使三者之间存在密切联系。因此,我们设想：石杉碱甲能通过影响胰岛素活性调节下游的PI3K/Akt/FOXO3a/NF-κB信号通路,参与调节衰老小鼠肝脏的炎症,进而保护肝脏,延缓衰老。[目的]1. 比较各组血液、肝脏胰岛素水平,探讨石杉碱甲对衰老所致胰岛素水平变化的作用。2. 比较各组肝脏PI3K、Akt、p-Akt、FOX03a、p-FOX03a的表达水平,进一步探讨石杉碱甲能否通过insulin/PI3K/Akt/FOXO信号通路调节肝脏细胞的氧化应激-炎症。3.比较各组肝脏MnSOD、MDA、NF-κB表达,探讨石杉碱甲对衰老大鼠肝脏氧化应激-炎症的影响。[方法]1.3月龄清洁级雄性小鼠36只,按随机数字表法平均分为三组：(1)石杉碱甲组(石杉碱甲0.1mg/Kg/d皮下注射)；(2)石杉碱甲+石杉碱甲拮抗剂组(石杉碱甲0.1mg/Kg/d*12个月+石杉碱甲拮抗剂5mg/Kg*3个月联合皮下注射)；(3)对照组(生理盐水皮下注射)。每组各12只小鼠,实验时间持续12个月。2.留取血液及肝脏组织,测定血液及肝脏组织胰岛素指标,比较三组胰岛素表达情况。3.免疫组织化学染色测定肝脏PI3K、Akt、p-Akt、FOXO3a、p-FOXO3a表达,Western Blot分析测定肝脏PI3K、Akt、p-Akt、FOXO3a、p-FOXO3a表达,利用图像分析软件对结果进行半定量测定,三组计量数据进行统计学比较分析。4.留取肝脏匀浆,全自动生化分析仪测定MnSOD指标,评估抗氧化酶能力。免疫组织化学染色测定肝脏NF-κB、MDA表达,Western Blot分析测定肝脏NF-κB、MDA表达,利用图像分析软件进行半定量分析,三组计量数据行统计学比较。[结果]1.肝脏组织中石杉碱甲组胰岛素水平低于对照组(F=14.125,P=0.02),石杉碱甲+拮抗剂组胰岛素水平也低于对照组(F=20.353,P=0.011),与石杉碱甲组无显著差异(F=3.086,P=0.154)。血液中石杉碱甲组胰岛素水平明显低于对照组(F=11.543,P=0.002),石杉碱甲+拮抗剂组胰岛素水平也低于对照组P=0.025),与石杉碱甲组无显著差异(F=0.410,P=0.527)。这提示,石杉碱甲可一定程度上降低衰老所致血液、肝脏组织中的胰岛素增加,石杉碱甲拮抗剂联合皮下注射3个月对其无明显影响。2.免疫组织化学染色显示,肝脏PI3K、p-Akt、p-FOXO3a表达在三组间也有明显差异(P<0.01),其中以对照组表达最高,石杉碱甲组表达最低(P<0.01)。肝脏Akt、FOXO3a表达在三组间有明显差异(P<0.05),其中以对照组表达最低,石杉碱甲组表达最高(P<0.05)。Western Blot半定量分析也显示,与对照组相比,石杉碱甲组肝脏FOXO3a表达明显上升(P<0.001)。石杉碱甲+拮抗剂组FOXO3a表达低于石杉碱甲组(P<0.05),但仍高于对照组(P<0.05)。与对照组相比,石杉碱甲组肝脏p-FOXO3a表达明显下降(P<0.001)。石杉碱甲拮抗剂干预可减弱这一下降效应(P<0.001),但仍低于对照组(P<0.001)。表明石杉碱甲可抑制肝脏胰岛素信号通路,降低肝脏P13K、p-Akt的表达,减少FOXO3a磷酸化。石杉碱甲拮抗剂可干预这一效应。3.分光光度法测定显示,石杉碱甲组肝脏MnSOD表达水平显著高于对照组(F=32.018,P<0.01),石杉碱甲+拮抗剂组MnSOD表达水平居于对照组(F=15.399,P=0.002)和石杉碱甲组(F=6.262,P=0.023)之间。提示石杉碱甲有助于肝细胞MnSOD表达,促进细胞抗氧化能力,延缓衰老,石杉碱甲拮抗剂可抑制这种作用。4.免疫组织化学染色显示,MDA表达在三组间有明显差异(P<0.05),其中以对照组表达最高,石杉碱甲组表达最低(P<0.05)。NF-κB表达在三组间也有明显差异(P<0.01),其中以对照组表达最高,石杉碱甲组表达最低(P<0.01)。表明石杉碱甲可有效抑制肝脏MDA、NF-κB表达。MDA表达在三组间有明显差异(P<0.05),其中以对照组表达最高,石杉碱甲组表达最低(P<0.01)。NF-κB表达在三组间有明显差异(P<0.01),其中以对照组表达最高,石杉碱甲组表达最低(P<0.01)。Western Blot半定量分析显示,与对照组相比,石杉碱甲组肝脏MDA表达下降(P<0.001)。石杉碱甲拮抗剂干预组表达较石杉碱甲组升高(P<0.001),但仍低于对照组(P<0.01)。这提示,石杉碱甲对衰老肝脏细胞氧化应激有抑制作用,可以减少肝脏MDA、NF-KB的表达,石杉碱甲拮抗剂可以抑制这一效应。推测石杉碱甲对氧化应激的抑制可能与石杉碱甲对胰岛素/PI3K/Akt/FOXO3a信号通路的调节作用有关。[结论]1.石杉碱甲可降低衰老小鼠肝脏的胰岛素水平,联合石杉碱甲拮抗剂皮下注射3个月对其作用无明显影响。2.石杉碱甲可抑制衰老小鼠肝脏胰岛素/PI3K/Akt/FOXO3a信号通路,参与调控肝脏细胞的衰老。石杉碱甲拮抗剂可减弱这一效应。3.石杉碱甲可促进衰老肝脏中MnSOD的表达,增强肝脏细胞抗氧化能力,石杉碱甲拮抗剂可减弱这一效应。4.石杉碱甲有助于清除衰老肝脏细胞内的脂质过氧化产物MDA,抑制氧化应激,延缓衰老。石杉碱甲拮抗剂可减弱这一效应。5.石杉碱甲可抑制衰老肝脏的NF-κB激活,从而抑制炎症因子的表达,延缓炎性衰老。石杉碱甲拮抗剂可减弱这一效应。