青光眼滤过术后滤过泡瘢痕化是手术失败的最主要原因。失败的滤过性手术的滤过泡结膜上皮下有异常增厚的致密胶原纤维结缔组织，伴有成纤维细胞的活跃增生，阻塞滤过道，从而失去房水引流功能。目前手术中经常联合使用的抗代谢药物，如五氟脲嘧啶（5-FU），丝裂霉素(mitomycin，MMC)等，虽然可以减少术后滤过道瘢痕形成，提高手术的成功率，但其抗代谢作用也可导致一系列术后低眼压、滤过泡渗漏等并发症，因此探索更加安全有效的治疗方法对抗青光眼术后瘢痕化有着重要的意义。<br> 细胞表型转化是纤维化过程中重要的细胞学基础，而转化生长因子-β(TGF-β)是成纤维细胞表型转化，进一步迁移、增殖，合成细胞外基质，导致滤过泡瘢痕化的重要细胞因子。人结膜下Tenon's囊成纤维细胞(human tenon'scapsule fibroblast，HTF)在青光眼术后滤过道瘢痕化的过程中扮演了主要的角色。在手术或损伤条件下，TGF-β水平增加，使局部的成纤维细胞(fibroblast，FB)激活并转化成肌成纤维细胞(myofibroblast，MF)启动伤口愈合反应。MF在伤口愈合的不同时期均起到重要作用，一旦创伤愈合，MF一般迅速恢复为FB或进入凋亡的程序，若MF持续存在，则会导致细胞的过度增殖、细胞外基质的合成增多，瘢痕形成，滤过道过早愈合，房水引流通道被阻，致使手术失败。<br> 由于TGF-β在细胞表型转化中的关键作用，越来越多的研究选择其作为研究靶点，通过降低TGF-β表达来抑制细胞表型转化，从而降低瘢痕化的程度。但由于TGF-β的下游信号通路非常复杂且相互形成交错网状，所以太低位点的调节可能对其促进细胞增殖及表型转化的作用不甚明显。因此我们考虑在信号通路的较高的位点:TGF-β膜受体，来进行干预，借此来探究MF表型转化的过程，以及纤维化的可能机制。<br> TGF-β的受体主要有3种，分别称为Ⅰ型（TGF-βRⅠ或活化素受体样激酶，activin receptor-like kinase，ALK）、Ⅱ型受体(TGF-βRⅡ)和Ⅲ型受体(TGF-βRⅢ)。其中Ⅰ、Ⅱ型受体主要参与信号通路的转导，两者的复合物与TGF-β相结合，导致Ⅰ型受体磷酸化，并激活下游的信号通路。大多数的哺乳动物细胞中，存在的RⅠ是ALK5，所以人们把ALK5作为研究TGF-β受体的重点。<br> 在前期的工作中，本研究组选择一种ALK5抑制剂SB-431542作为工具，研究抑制ALK5对青光眼术后滤过道瘢痕化的作用，结果显示滤过术后局部球结膜下注射SB-431542可以抑制滤过道瘢痕形成。由此，我们认为，ALK5可能与调控TGF-β致瘢痕化有重要关系，我们希望通过建立细胞及动物的瘢痕化模型，并人为调控其中ALK5的水平，观察其对细胞表型转化及纤维化的影响作用，探索ALK5抑制剂在结膜损伤后局部组织重塑中的作用及其细胞学机制，为抑制青光眼滤过道瘢痕化的研究提供更多的理论依据。<br> 目的:研究细胞因子TGF-β1对HTF细胞及动物青光眼术后滤过道瘢痕化模型中，活化素受体样激酶5(activin receptor-like kinase5， ALK5)表达的调控作用，并通过慢病毒转染技术建立ALK5基因高表达的细胞及动物模型，人为调控ALK5表达，研究ALK5水平对青光眼滤过术后滤过道瘢痕化的影响。<br> 材料和方法:<br> 第一部分:原代培养人结膜下Tenon's囊成纤维细胞，并进行细胞鉴定。取对数生长期细胞，以10μg/μl的TGF-β1诱导HTF，在不同的时间，采用Western Blot检测平滑肌肌动蛋白(α-SM-actin)和纤连蛋白（fibronectin，FN）蛋白表达，确定细胞发生表型转化及纤维化。再采用Western Blot和免疫细胞化学技术来鉴定ALK5蛋白的表达，并以实时定量PCR检测ALK5 mRNA水平。<br> 第二部分:采用Tronolab慢病毒载体系统，构建过表达ALK5基因的慢病毒载体，转染HTF细胞，获得过表达ALK5的HTF细胞。观察细胞生长特性，。采用普通培养基，以及加入ALK5抑制剂SB-431542的培养基分别培养转染及未转染的HTF细胞，观察细胞生长特性，MTT试验检测细胞增殖能力。并用10μg/μl的TGF-β1诱导HTF，Western Blot检测相关表型转化(α-SMA)、纤维化指标(FN)以及凋亡指标(Caspase-3)的表达。<br> 第三部分:1.应用滤过性手术建立兔滤过道瘢痕化动物模型，选用24只健康新西兰白兔作为实验动物，随机分为3组:对照组、ALK5组、0.5mMSB-431542组。在全身麻醉下行左眼滤过性手术。术后观察、测量眼压(intraocularpressure，IOP)。术后第3、7、14、28天4个时间点各处死每组2只实验兔，摘除眼球，制作切片，免疫组化染色，光镜下观察滤过道α-SM-actin、ALK5及瘢痕化情况。2.对30只健康的新西兰白兔施行右眼滤过性手术。随机分为5组，对照组(NS+NS)、阴性对照组(NS+0.5mM SB-431542组)、高表达组(ALK5转染+NS)、高表达+低剂量给药组（ALK5转染+0.5mM SB-431542组）和高表达+高剂量给药组(ALK5转染+2.0mM SB-431542组)，每组6只兔（6只眼，n=6）。术后观察并测量眼压。术后第28d处死实验兔，摘除实验眼，制作切片，免疫组化染色，检测α-SM-actin、ALK5及瘢痕化情况。<br> 结果:<br> 第一部分:贴壁法培养的人结膜下Tenon's囊组织，约3-5天可见组织块周围爬出梭形细胞，继续培养逐渐汇合成片，经传代后进行波形蛋白(vimemin)染色，鉴定为成纤维细胞。 TGF-β1诱导HTF后，ALK5的mRNA表达有所上调，于12-24h达到高峰值。Western B
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