糖皮质激素反常诱导人羊膜成纤维细胞胞浆型磷脂酶A_（2α）表达的分子机制  学位论文  

早产和过期产严重危害新生儿健康,目前尚缺乏有效的干预手段,其主要原因在于人类分娩启动机制尚未解析。前列腺素是公认的哺乳类动物包括人类分娩启动的最后通路,花生四烯酸是前列腺素的重要合成前体,而胞浆型磷脂酶A2α(cPLA2α)是负责从磷脂释放花生四烯酸最为重要的磷脂酶。人类妊娠晚期子宫内组织大量表达cPLA2α,其中以羊膜组织表达量最高,约占整个子宫内组织磷脂酶活性的70%左右。随孕期进展,人羊膜cPLA2α表达量随之增加,在分娩启动之前达到最高峰值,因此人羊膜cPLA2α水平上升被认为是分娩启动中 的重要事。糖皮质激素是公认的经典抑制炎症激素,在多数细胞中糖皮质激素抑制cPLA2α表达,但是在人羊膜成纤维细胞中,糖皮质激素却反常诱导cPLA2α表达,糖皮质激素的这一反常诱导作用被认为是人类分娩启动的关键环节之一,但是糖皮质激素此反常诱导作用的分子机制至今仍未解析。 本研究采用对糖皮质激素具有反常反应的原代人羊膜成纤维细胞和对糖皮质激素具有经典反应的人胎儿肺成纤维细胞株(HFL-1)为研究模型,采用实时荧光定量PCR、Western blotting、启动子克隆与活性测定、RNA干扰和功能蛋白过表达、免疫共沉淀、染色质免疫沉淀和ELISA等实验技术,联合类固醇激素及其受体阻断剂给药、信号通路激动剂及拮抗剂给药和蛋白酶抑制剂给药等实验方法,通过比较糖皮质激素对两种细胞模型cPLA2α表达的不同调控,分析得到了糖皮质激素反常诱导人羊膜成纤维细胞cPLA2α表达的一些关键因素。冀希望通过此研究为解析人类分娩启动机制和临床干预早产以及过期妊娠提供新的思路。主要实验结果如下： 1.实时荧光定量PCR和Western blotting实验表明,皮质醇(0.01-1μM)呈剂量依赖性反常诱导人羊膜成纤维细胞cPLA2α表达,该诱导作用与皮质醇对HFL-1细胞cPLA2α表达的经典抑制作用形成鲜明对比。 2.采用实时荧光定量PCR和Western blotting实验发现,皮质醇(1μM)对人羊膜成纤维细胞cPLA2α表达的诱导作用被糖皮质激素受体(GR)拮抗剂RU486(1μM)、mRNA转录抑制剂DRB (75μM)和蛋白质合成抑制剂CHX(10μM)阻断,提示皮质醇对人羊膜成纤维细胞cPLA2α表达的诱导作用需要糖皮质激素受体(GR)参与介导,该作用发生在转录水平,此外,该作用还需要合成其他蛋白参与。 3.实时荧光定量PCR和Western blotting实验发现,皮质醇(0.01-1μM)剂量依赖性抑制包括白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α和白细胞介素6三种早产相关的重要促炎症细胞因子mRNA的表达；此外,皮质醇(1μM)能够正常诱导人羊膜成纤维细胞NFκB抑制因子-IκBα的表达。上述实验结果提示,皮质醇对人羊膜成纤维细胞NFκB炎症通路和上述促炎性细胞因子的经典抑炎作用没有发生异常,皮质醇无法通过反常激活上述炎症通路来参与对人羊膜成纤维细胞cPLA2α表达的上调作用。 4. ELISA、常规PCR和Western blotting实验发现,原代人羊膜成纤维细胞本身能够合成分泌少量孕激素；而且,该细胞表达的孕激素受体以A亚型(PRA)为主,基本不表达B亚型。免疫共沉淀实验、siRNA基因沉默和PRA过表达实验发现,人羊膜成纤维细胞内源性孕激素能够激活自身的PRA, PRA进一步与GR形成异源二聚体,削弱GR的转录功能,从而削弱皮质醇对人羊膜成纤维细胞cPLA2α表达的诱导作用。此外,采用外源性孕激素模拟人类妊娠晚期高浓度孕激素环境对皮质醇功能影响的实验发现,孕激素本身对人羊膜成纤维细胞cPLA2α基础表达无明显作用,但是当孕激素浓度高出皮质醇浓度10倍以上时,孕激素显著性削弱皮质醇对cPLA2α的诱导作用。上述实验结果表明,人羊膜成纤维细胞表达的PRA不利于皮质醇功能的发挥,而且,人类妊娠晚期所特有并区别于其他多数哺乳动物的高浓度孕激素环境也不利于皮质醇功能的发挥,因此,皮质醇对人羊膜成纤维细胞cPLA2α的诱导作用与上述高浓度孕激素环境无关。 5.将cPLA2α启动子克隆并构建进入报告基因质粒,转染细胞后测定启动子活性发现,皮质醇促进人羊膜成纤维细胞-595bp cPLA2α启动子活性,表明介导皮质醇反常诱导cPLA2α的关键序列位于该595bp序列之内。采用PCR克隆含有GRE顺式元件突变位点的启动子进行报告基因活性测定实验和染色质免疫沉淀实验发现,皮质醇对人羊膜成纤维细胞cPLA2α启动子活性的促进作用是通过皮质醇促进GR与位于cPLA2α启动子-490bp--485bp位置的远端GRE元件结合实现的,令人意外的是,该GRE元件却在HFL-1细胞中介导了皮质醇对cPLA2α启动子活性的抑制作用,提示皮质醇对人羊膜成纤维细胞cPLA2α表达促进作用的决定因素不仅需要GR参与,还有其他因素参与。 6.利用信号转导通路工具药(cAMP、Forskolin和H89等)、Western Blotting和染色质免疫沉淀等技术研究发现,皮质醇能够激活人羊膜成纤维细胞cAMP/PKA/CREB-1信号转导通路,增加CREB-1的第133位Ser的磷酸化水平；磷酸化的CREB-1能够与GR结合形成促转录复合体,共同定位到cPLA2α启动子-490bp--485bp位置远端GRE元件,最终完成皮质醇对cPLA2α转录表达的促进作用。此外,采用第133位Ser突变为Ala的重组表达载体(dn-CREB-1质粒)转染细胞发现,过表达dn-CREB-1能够削弱皮质醇对cPLA2α表达的诱导作用,该结果与上述结论一致。有趣的是,皮质醇对HFL-1细胞CREB-1的磷酸化具有抑制作用,该结果与皮质醇对人羊膜成纤维细胞CREB-1磷酸化的诱导作用形成鲜明对比。上述结果提示皮质醇对人羊膜成纤维细胞cPLA2α的反常诱导作用的决定因子与能够激活cAMP/PKA/CREB-1信号通路的因子密切相关。 7利用信号转导通路工具药(RU486和NF449)并结合Western Blotting技术研究发现,皮质醇诱导人羊膜成纤维细胞Gαs表达增加,该诱导作用可以被RU486阻断,与此形成鲜明对比的是,皮质醇并不影响HFL-1细胞Gas的表达水平。将上述结果结合CHX的实验结果,提示Gαs很可能是介导糖皮质激素反常诱导cPLA2α表达的关键蛋白之一。进一步研究发现,Gαs活性抑制剂NF449既能够削弱皮质醇对人羊膜成纤维细胞CREB-1的促磷酸化作用,也能够削弱皮质醇对该细胞cPLA2α表达的诱导作用,提示皮质醇所诱导的Gαs是皮质醇反常诱导人羊膜成纤维细胞cPLA2α表达的关键因素之一 综上所述,皮质醇对人羊膜成纤维细胞cPLA2α表达的反常诱导作用与NFκB炎症通路的反转无关,与人类妊娠晚期特有的高浓度孕激素环境无关,而与cAMP/PKA/CREB-1信号通路激活密切相关。初步解析的分子机制如下：皮质醇通过诱导人羊膜成纤维细胞Gas表达,从而激活cAMP/PKA/CREB-1信号通路,使得CREB-1第133位苏氨酸(Ser)磷酸化增加,磷酸化CREB-1与激活的GR形成促转录复合体,该复合体定位到cPLA2α启动子远端位于-490bp--485bp之间的GRE元件上,最终促进cPLA2α的表达。在HFL-1细胞中,皮质醇无法通过以上事件来诱导cPLA2α表达。