大鼠脊髓胶质细胞在癌痛中的功能活动变化及电针缓解癌痛作用观察  学位论文  

癌痛即恶性肿瘤引起的疼痛，是临床上常见的慢性病理性疼痛之一，严重影响了患者的生活质量。据统计资料表明，肿瘤患者中约有30-50％伴有轻到中度的疼痛，而在肿瘤晚期或转移性肿瘤患者中，约有75-95％的患者伴有严重的疼痛而需要接受治疗。依据WHO倡导的三阶梯疗法，即根据疼痛程度不同给予非甾体类抗炎镇痛药和／或阿片类药物治疗，取得了一定的成效。但是由于目前各种疗法的局限性，仍有大约45％的癌痛患者的疼痛得不到有效控制。因此，建立适宜的癌痛动物模型，为研究癌痛机理及寻找新的能有效缓解癌痛的方法奠定基础，这是当前慢性痛研究领域的热点之一。 研究证明，癌痛时脊髓背角强啡肽免疫阳性神经元增加，同侧脊髓背角星形胶质细胞显著增生，这一现象在炎症痛模型中非常罕见，在神经痛模型上只有外周神经严重损伤时才会出现。以往研究提示癌痛是一种机理独特的慢性痛。越来越多的证据表明，神经胶质细胞与慢性痛密切相关。一方面，胶质细胞在主要的痛觉传递物质谷氨酸的代谢、摄取、合成、清除中起重要作用，另一方面，胶质细胞释放的致炎细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α等)、前列腺素等是引起痛觉传递神经元敏化的主要因素，促进中枢敏化形成。因此，胶质细胞在痛觉的初级传入和整合中起重要作用，在痛觉调制尤其是慢性痛中枢敏化的形成与维持中起着举足轻重的作用。那么胶质细胞在癌痛时到底有何变化是本课题研究的一个问题。 针刺镇痛是祖国医学的精华之一，具有作用广，毒副作用小，经济简便等优点。国内外大量研究表明，针刺对急性痛和慢性痛都有一定的镇痛作用。临床实践初步提示，应用针刺于癌痛病人，不仅能够镇痛，还能通过针刺调节癌症患者的免疫功能，从而有助于提高癌症患者的生活质量。但是长期以来，由于缺乏合适的癌痛实验动物模型，阻碍了对癌痛机理的研究，也就影响了新的有效的癌痛治疗方法的研究，包括一些癌痛新药及针刺等非药物疗法等。直到1998年，Wacnik等首先报道了小鼠癌痛模型，而后又有多个癌痛实验动物模型相继问世。这些癌痛动物模型的出现为开展中西医结合针刺及针药结合治疗癌痛提供了契机。 综上所述，本论文拟开展下列研究： 1．建立癌痛动物实验模型 (1)参照Medhurst等报道的大鼠胫骨癌痛模型，改良、建立新的大鼠胫骨癌痛模型，通过测定模型大鼠体重、胫骨病理、胫骨X光片、后肢热痛觉过敏、机械性痛觉超敏(触诱发痛)、双侧后肢负重能力以及自发性疼痛，对模型进行综合评估； (2)建立新的大鼠跟骨癌痛模型，通过测定后肢热痛觉过敏、机械性痛觉超敏等对模型进行评估； (3)参照文献，建立小鼠皮肤癌痛模型，通过测定小鼠脚掌皮肤黑色素瘤肿胀周长、热痛觉过敏对模型进行评估； 2．观察癌痛时大鼠脊髓背角胶质细胞功能活动变化，探讨胶质细胞在癌痛中的作用 (1)运用免疫组织化学、Western Blot、RT-PCR等形态学及分子生物学技术检测大鼠胫骨癌痛时脊髓背角星形胶质细胞标记蛋白GFAP的表达变化； (2)运用免疫组织化学、Western Blot、RT-PCR等形态学及分子生物学技术检测大鼠胫骨癌痛时脊髓背角小胶质细胞标记蛋白CD11b的表达变化； (3)运用RT-PCR方法检测大鼠胫骨癌痛时脊髓背角少突胶质细胞标记蛋白MOSP的表达变化； (4)运用RT-PCR和ELISA方法检测大鼠胫骨癌痛时脊髓背角致炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达变化； (5)运用RT-PCR方法检测大鼠胫骨癌痛时脊髓背角Toll样受体(Toll like receptor，TLR)的表达变化； 3．观察电针和／或西乐葆对癌痛的缓解作用 (1)观察电针对小鼠皮肤癌痛时热痛觉过敏的影响； (2)观察电针对大鼠胫(跟)骨癌痛时机械性痛觉超敏的影响； (3)观察不同剂量西乐葆对大鼠胫骨癌痛时机械性痛觉超敏的影响； (4)观察电针合用小剂量西乐葆对大鼠胫骨癌痛时机械性痛觉超敏的影响。 实验结果如下： 1．癌痛动物实验模型的建立 (1)大鼠胫骨癌痛模型 本研究参照Medhurst等报道的癌痛模型进行改进，采用微量进样器直接经皮穿刺向Wistar大鼠胫骨骨髓腔内接种Walker 256乳腺癌细胞，率先在国内建立新的大鼠胫骨癌痛模型。Wistar大鼠随机分成五组：正常组(Normal)、PBS组、热灭活细胞组(Heat-Killed)、低剂量肿瘤细胞组(4×10~3)、高剂量肿瘤细胞组(4×10~5)。与正常组、PBS和热灭活细胞组大鼠相比，肿瘤组大鼠X光片显示胫骨骨密度不均一，提示存在进行性骨质破坏；骨HE切片染色显示存在明显的肿瘤生长、骨质破坏以及新生骨形成；大鼠接种肿瘤细胞后，大鼠体重逐渐降低，接种侧后肢逐渐产生自发性疼痛，机械性痛觉超敏以及后肢负重能力降低，疼痛行为随时间及骨破坏的加重而加重。以上结果提示该模型很好的模拟了临床骨癌痛患者的临床表现。 新模型改用腹水瘤细胞，避免了繁琐的细胞体外培养过程，采用经皮穿刺接种肿瘤细胞从而简化造模过程，同时也减少了由于开创手术引起的感染，因此与国际上报道的模型相比，新模型在保证模型稳定性的前提下，具有操作简便，手术创伤小，成功率高的优点。值得注意的是，该癌痛大鼠肿瘤接种对侧后肢机械性痛阈也降低，提示该癌痛模型可能存在“镜像痛”，这在癌痛模型上尚未见有报道。本实验为深入开展癌痛机理研究提供了一个新的有价值的癌痛实验动物模型。 (2)大鼠跟骨癌痛模型 Wistar大鼠随机分为四组：正常组(Normal)、PBS组、肿瘤细胞组(4×10~3)。大鼠跟骨内接种Walker 256大鼠乳腺癌细胞后，低剂量和高剂量肿瘤细胞组大鼠肿瘤接种侧后肢均逐渐出现机械性痛觉超敏，并且这种机械性痛觉超敏也出现在肿瘤接种侧对侧后肢。但在实验过程中未观察到大鼠后肢有显著热痛觉过敏。 (3)小鼠皮肤癌痛模型 C57BL／6小鼠随机分为两组：热灭活肿瘤细胞组(Heat-Killed)、肿瘤细胞组(B16-BL6)。小鼠单侧脚掌皮下接种B16-BL6黑色素瘤细胞，对侧脚掌接种等体积的PBS作为对照，建立小鼠皮肤癌痛模型。建模后小鼠后肢脚掌肿胀周长逐渐增加，辐射热和热板法测定结果表明，从第8天开始小鼠热痛阈逐渐降低，第14天热痛觉过敏最为显著。 小结：以上实验通过将Walker 256大鼠乳腺癌细胞和B16-BL6小鼠黑色素瘤细胞分别接种至大鼠单侧胫骨或者跟骨以及小鼠单侧后肢脚掌皮下，大鼠或小鼠表现出一定的痛行为改变，表明本研究建立的大鼠胫骨或跟骨癌痛模型以及小鼠脚掌皮肤癌痛模型是成功的。大鼠胫(跟)骨癌痛时，肿瘤细胞接种对侧后肢也出现机械性痛觉超敏，提示该癌痛模型可能存在“镜像痛”。 2．大鼠胫骨癌痛时脊髓背角胶质细胞功能活动变化 (1)大鼠胫骨癌痛时脊髓背角星形胶质细胞增生肥大 实验分为正常组(Normal)、PBS组、热灭活肿瘤细胞组(Heat-Killed)、肿瘤细胞组(4×10~5)。用免疫组织化学、Western Blot、RT-PCR等形态学及分子生物学技术检测大鼠胫骨癌痛时脊髓背角星形胶质细胞标记蛋白GFAP表达变化。 免疫组织化学实验显示，与正常组和PBS组相比，大鼠胫骨接种肿瘤细胞后第8、16、30天，脊髓背角星形胶质细胞显著增生肥大。Western Blot结果显示，与正常组和PBS组相比，热灭活肿瘤细胞组和肿瘤细胞组大鼠脊髓背角星形胶质细胞标记蛋白GFAP表达显著增高。RT-PCR结果显示，大鼠脊髓背角星形胶质细胞标记蛋白GFAP mRNA在胫骨癌痛时随着时程增加有增高趋势。有趣的是，上述研究中，在肿瘤接种的对侧脊髓背角也观察到相似的变化。 (2)大鼠胫骨癌痛时脊髓背角小胶质细胞增生肥大 实验分为正常组(Normal)、PBS组、热灭活肿瘤细胞组(Heat-Killed)、肿瘤细胞组(4×10~5)。用免疫组织化学、Western Blot、RT-PCR等形态学及分子生物学技术检测大鼠胫骨癌痛时脊髓背角小胶质细胞标记蛋白CD11b表达变化。 免疫组织化学实验显示，与正常组和PBS组相比，大鼠胫骨接种肿瘤细胞后第8、16、30天，脊髓背角小胶质细胞显著增生肥大。Western Blot结果显示，与正常组和PBS组相比，热灭活肿瘤细胞组和肿瘤细胞组大鼠脊髓背角小胶质细胞标记蛋白CD11b表达显著增高。RT-PCR结果显示，大鼠脊髓背角小胶质细胞标记蛋白CD11b mRNA在胫骨癌痛时随着时程增加表现出升高趋势。同样在上述研究中，在肿瘤接种的对侧脊髓背角也观察到相似的变化。 (3)大鼠胫骨癌痛时脊髓背角少突胶质细胞变化 实验分为正常组(Normal)、PBS组、热灭活肿瘤细胞组(Heat-Killed)、肿瘤细胞组(4×10~5)。运用RT-PCR方法检测脊髓背角少突胶质细胞标记蛋白髓磷脂(Myelin／Oligodendrocyte Specific Protein，MOSP)的表达变化。 RT-PCR结果显示，与正常组、PBS组和热灭活肿瘤细胞组相比，肿瘤细胞组大鼠在肿瘤细胞接种后第8天、16天双侧脊髓背角少突胶质细胞标记蛋白MOSPmRNA的表达无显著差异。 (4)大鼠胫骨癌痛时脊髓背角致炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达变化 实验分为正常组(Normal)、PBS组、热灭活肿瘤细胞组(Heat-Killed)、肿瘤细胞组(4×10~5)。运用RT-PCR和ELISA方法检测大鼠胫骨癌痛时脊髓背角致炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达变化。 RT-PCR结果显示，与正常组、PBS组和热灭活肿瘤细胞组相比，肿瘤细胞组大鼠单侧胫骨接种肿瘤细胞后第8天、16天同侧脊髓背角致炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA水平显著提高，并且随着时程的增加表现出升高趋势。但ELISA结果显示，与正常组相比，大鼠单侧胫骨接种肿瘤细胞后第8天同侧脊髓背角致炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量均显著降低，而接种肿瘤细胞后第16、22天与正常组相比无显著性差别，与接种肿瘤后第8天相比双侧脊髓背角致炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量显著升高。同样在实验中观察到，脊髓背角致炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达的变化是双侧的。 (5)运用RT-PCR方法检测大鼠胫骨癌痛时脊髓背角TLR mRNA的表达变化； 实验分为正常组(Normal)、PBS组、热灭活肿瘤细胞组(Heat-Killed)、肿瘤细胞组(4×10~5)。用RT-PCR方法检测大鼠胫骨癌痛时脊髓背角小胶质细胞另一标记蛋白Toll样受体(TLR)的表达变化。 RT-PCR结果显示，与正常组、PBS组、热灭活细胞组大鼠相比，大鼠单侧胫骨接种肿瘤细胞后第16天，双侧脊髓背角Toll样受体TLR4和TLR2 mRNA显著增高。PBS组、热灭活细胞组大鼠与正常组大鼠相比无显著改变。与正常组大鼠相比，肿瘤细胞组大鼠双侧脊髓背角Toll样受体TLR4和TLR2 mRNA在造模后第8、16、22天随着肿瘤生长逐渐增高。 小结：大鼠接种肿瘤细胞以后，双侧脊髓背角星形胶质细胞标记蛋白GFAP和小胶质细胞标记蛋白CD11b表达增加，双侧脊髓背角星形胶质细胞和小胶质细胞存在增生肥大，同时双侧脊髓背角分泌的致炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达增加，提示癌痛时脊髓背角星形胶质细胞和小胶质细胞被激活，可能参与了癌痛的过程。有趣的是，癌痛时脊髓背角星形胶质细胞和小胶质细胞激活是双侧的，提示双侧胶质细胞激活可能与该癌痛模型中的“镜像痛”有关。这在其它的癌痛模型中也未见报道。但是脊髓胶质细胞在癌痛中的确切作用还有待于进一步深入研究。 3．观察电针和／或西乐葆对癌痛的缓解作用 (1)电针对小鼠皮肤癌痛时热痛觉过敏的影响 实验分两部分：单次电针治疗和多次电针治疗。单次电针治疗分为模型组(B16-BL6)、模型+电针组(B16-BL6+EA)。多次电针组分为模型组(B16-BL6)、电针组(B16-BL6+EA)和假电针组(B16-BL6+sham EA)。电针治疗时，小鼠肿瘤接种侧对侧取穴“足三里”和“昆仑”，通过G6805-1A型电针治疗仪给予“疏密波”(疏波频率约4Hz，串长2.85s，密波频率约100Hz，串长1.05s)，强度以引起小鼠后肢肌肉轻微抖动而不嘶叫为宜(约1mA)，每次治疗时间为30分钟。单次电针在肿瘤接种后第8天和20天给予，电针结束后热板法测定小鼠热缩爪潜伏期观察热痛阈的变化，每15-20分钟测定一次。多次电针分别在接种肿瘤细胞后第8天和16天开始给予，隔日一次，电针后第二天辐射热法和热板法测定小鼠热缩爪潜伏期观察热痛阈的变化。 结果显示，小鼠造模后第8天给予单次电针治疗具有显著的即刻镇痛作用，治疗结束后15-30分钟达到最佳镇痛作用，50分钟镇痛作用消失。但是第20天给予单次电针治疗则未观察到显著镇痛作用。第8天开始给予多次隔日电针治疗具有显著镇痛作用，但是第16天开始给予隔日电针治疗则未观察到显著镇痛作用。说明电针在皮肤癌痛的早期有镇痛作用，而在晚期则无作用，提示电针的镇痛效应与癌痛时程密切相关。 (2)电针对大鼠胫(跟)骨癌痛时机械性痛觉超敏的影响 实验分为胫骨和跟骨癌痛两部分。每部分实验分为肿瘤细胞组和电针组(EA)。电针治疗时，大鼠双侧取穴“足三里”和“昆仑”，通过G6805-1A型电针治疗仪给予“疏密波”(疏波频率约4Hz，串长2.85s，密波频率约100Hz，串长1.05s)，强度以引起大鼠后肢肌肉轻微抖动而不嘶叫为宜(约1mA)，每日治疗一次，每次治疗时间为30分钟。电针治疗结束后测定大鼠后肢机械性痛阈的变化。结果显示，在癌痛的早期或晚期给予多次电针治疗，电针组与模型组大鼠机械性痛阈在实验过程中均无显著性差异，提示多次电针未能有效缓解胫(跟)骨癌痛时的机械性痛觉超敏。 (3)不同剂量西乐葆对大鼠胫骨癌痛时机械性痛觉超敏的影响 非甾体类消炎镇痛药(NSAIDS)西乐葆(celebrex)是一种选择性COX-2酶抑制剂，可以通过抑制环氧合酶COXs的活性而产生镇痛作用。本实验分为甲基纤维素对照组(MC)、西乐葆5 mg／kg／day组、西乐葆10 mg／kg／day组、西乐葆30 mg／kg／day组。造模后第四天开始时间灌胃给药，每天早晚八时各一次。结果显示，西乐葆10 mg／kg／day治疗组大鼠后肢机械性痛阈第26、30天较甲基纤维素(溶剂对照)组显著提高。而在西乐葆5、30mg／kg／day组中，大鼠右侧后肢机械性痛阈值与模型组大鼠相比无显著性差异。西乐葆5 mg／kg／day无镇痛作用可能是药物浓度太低不足以达到镇痛作用，而在西乐葆30mg／kg／day中大鼠在灌胃后行为反常，互相挤压、踩踏，争抢喝水，提示这一剂量西乐葆对大鼠具有一定毒性作用，可能是因为药物浓度过高，产生较强的胃肠道反应和毒副作用，因此无法观察到镇痛作用。 (4)电针合用小剂量西乐葆对大鼠胫骨癌痛时机械性痛觉超敏的影响 实验分为肿瘤细胞模型组(model)、模型+电针组(model+EA)、模型+西乐葆组(model+celebrex 5 mg／kg／day)、模型+电针+西乐葆组(model+EA+celebrex5 mg／kg／day)。结果显示，与模型组大鼠相比，电针组和给予西乐葆5mg／kg／day的大鼠，在整个实验过程中，其右侧后肢von Frey细丝引起机械性痛阈值无显著性差异。电针合用西乐葆5mg／kg／day的大鼠，其机械性痛阈值与模型组大鼠相比，在第10天、第22天及第27天，均有显著性差异。 小结：电针对小鼠皮肤癌痛具有一定的镇痛作用，电针对癌痛的镇痛作用与癌痛的类型、癌痛的部位以及时程有关。单用电针或者单用小剂量西乐葆5mg／kg／day对大鼠骨癌痛无显著镇痛作用。而电针合用小剂量西乐葆与单用电针或者单用小剂量西乐葆相比，其机械性痛阈值显著提高。提示电针与小剂量西乐葆具有协同作用，二者合用可以增强对骨癌痛的镇痛效果，从而为癌痛治疗提供一种针药结合新方法。 综上所述，本研究提示： 1．大鼠接种肿瘤细胞后表现出机械性痛觉超敏等一系列痛行为改变，小鼠接种肿瘤细胞后表现出热痛觉过敏，表明癌痛模型制作成功。 2．大鼠单侧胫骨接种肿瘤细胞后，双侧后肢机械性痛阈降低，双侧脊髓背角星形胶质细胞和小胶质细胞增生肥大，提示在大鼠胫骨癌痛模型上可能存在“镜像痛”。 3．大鼠胫骨癌痛时，双侧脊髓背角星形胶质细胞和小胶质细胞增生肥大，脊髓背角致炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达增加，提示癌痛时脊髓背角星形胶质细胞和小胶质细胞被激活，双侧激活的胶质细胞可能参与了该癌痛模型上双侧机械性痛觉超敏。 4．大鼠胫骨癌痛时，双侧脊髓背角TLR(4，2)mRNA表达增加，提示TLR-小胶质细胞-致炎细胞因子通路可能参与了癌痛的过程。 5．电针对小鼠皮肤癌痛具有一定的镇痛作用；电针对大鼠胫(跟)骨癌痛无显著的镇痛作用；电针对癌痛的镇痛作用与癌痛的类型、癌痛的部位以及时程有关。 6．西乐葆(10mg／kg／day)对大鼠胫骨癌痛有显著镇痛作用，小剂量西乐葆(5mg／kg／day)对大鼠胫骨癌痛无显著镇痛作用。 7．电针合用小剂量西乐葆对大鼠胫骨癌痛具有显著镇痛作用，提示电针与小剂量西乐葆具有协同作用，二者合用可以增强对骨癌痛的镇痛效果。