结核病是由结核分支杆菌引起的一种严重的人类传染性疾病。近年来，耐药结核杆菌的出现，寻找新型抗结核杆菌的药物及控制结核病势在必行。莽草酸途径是细菌生长所必需而人类不存在的代谢途径，因此成为筛选新型抗微生物药物的潜在作用靶标。本研究对该代谢途径的关键酶-莽草酸脱氢酶基因进行克隆、表达以及酶学性质分析，并筛选该蛋白的抑制剂及探索这些小分子化合物对结核杆菌的抑制作用。 1、论文的第二章，对结核分支杆菌基因组中编码莽草酸脱氢酶基因(aroE)进行克隆，并表达纯化了该蛋白。通过对编码莽草酸脱氢酶基因进行序列分析，发现莽革酸脱氢酶基因序列中具有G-X-(N/S)-V-(T/S)-X-P-X-K模式序列，该序列是莽草酸脱氢酶家族中高度保守模式。利用园二色仪对重组莽革酸脱氢酶蛋白进行二级结构测定，该重组蛋白中含有a-helix，β-sheet,β-turn，和randomcoil分别为29.2％，9.3％，32.7％，和28.8％。酶活性质分析表明该重组莽草酸脱氢酶发挥酶活效应的最适pH值为9.0-12，最适温度为63℃。以莽草酸为底物的Km值为29.5μM，NADP为底物的Km值为63μM。二价金属离子Ni2+，Zn2+andMg2+对重组蛋白酶活性有较弱的增强作用。莽草酸脱氢酶酶学性质的研究为以该酶作为抗结核杆菌药物靶标筛选抑制剂和新型药物奠定基础。 2、论文的第三章，介绍了针对莽草酸脱氢酶的虚拟筛选工作。在工作中，首先采用蛋白质三维模建的方法，对结核杆菌的莽草酸脱氢酶进行结构模拟，然后采用分子对接方法对产生的数据库进行搜索，筛选出可与该蛋白分子结合的小分子化合物82个。从酶学水平检测这些小分子化合物对莽草酸脱氢酶活性的抑制作用，筛选出可有效抑制该酶活性的化合物20个，半数抑制浓度(IC50)结果表明有6种化合物的IC50小于100ug/ml，分别为83.947±4.373ug/ml，69.953±5.50ug/ml，96.953±5.50ug/ml，94.162±0.425ug/ml，95.949±1.54ug/ml。研究还发现，蛋白与化合物预孵育时间对化合物的抑制作用有一定的影响，随着孵育时间增加，抑制作用增强。 3、论文的最后部分，检测了小分子化合物对培养中结核分枝杆菌H37Ra株的生长抑制作用，并初步检测几种小分子化合物对临床分离的耐药菌株的抑制作用。试验结果表明：在82种化合物中，有22种化合物在200ug/ml的浓度下，可以完全抑制结核杆菌的生长。其中MIC小于100ug/ml的化合物10种，并有4种化合物的MIC小于50ug/ml和小于20ug/ml的化合物2种，这两种化合物分别为S802855，MIC=18.25ug/ml；S802824化合物，MIC=6.25ug/ml。 通过测定化合物S802855和S802824化合物对细菌生长曲线影响，我们分别采用在培养细菌0-4周过程中，分别添加0，0.1×MIC，1×MIC和10×MIC浓度药物，并每周采样评价化合物对细菌的生长情况的抑制作用。结果发现：这两种化合物在0.1×MIC浓度下对细菌的抑制作用较弱，与对照不加任何化合物的细菌生长相比，只抑制约0.1-0.2Log单位。在1×MIC浓度作用下，细菌对化合物较为敏感，可以抑制细菌生长1-2Log单位。在10×MIC浓度作用下，S802824化合物对细菌是完全杀死的，而且这种抑制作用是持续的；S802855化合物在细菌生长的早期(0-1周)添加时，对细菌是完全杀死的。但在细菌生长2周后添加该浓度的化合物，则不能完全杀死细菌，抑制细菌生长水平为1-1.5Log单位。 通过添加8mM浓度的莽草酸，可以弥补化合物对细菌的抑制作用，而且在化合物使用浓度为0.1×MIC和1×MIC时，可以完全恢复细菌的生长，在10×MIC的浓度下，只能部分恢复细菌生长状态。这一结果进一步从实验中证实化合物是通过作用于莽草酸脱氢酶发挥功能的。化合物对临床多重耐药菌株的抑制作用测定结果表明：一种化合物对临床耐药菌株的MIC为11.13ug/ml，低于该化合物对敏感有毒株H37Rv的抑制。以莽草酸脱氢酶为药物靶标筛选新型抗结核药的研究为开发新型抗结核药物奠定基础。
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