肥胖及相关的代谢性疾病诸如二型糖尿病,心血管疾病及癌症已经成为人类健康的重大威胁。生活环境的改变无疑是推动肥胖患病率上升的一大因素,然而我们更应该关注在相同环境下不同遗传背景所导致的个体体重的差异。所以很有必要采用遗传手段研究涉及到体重调节和肥胖易感相关的基因。在2004年中国上海市瑞金医院内分泌科做的基因芯片研究中,作者各取2例正常人及单纯肥胖患者的大网膜脂肪组织做基因表达谱分析。2007年另一研究中,作者选取二型糖尿病患者作为研究对象,比较肥胖及非肥胖患者肝组织差异表达的基因。在上述两篇文章的研究中,其中有一个基因SCO1,在肥胖患者脂肪组织及肥胖患者肝脏组织中均较对照组高。以上结果提示SCO1与肥胖的发生有潜在的相关性。但是SCO1是否参与肥胖的发生,目前还不清楚。SCO1是镶嵌在线粒体内膜的一种金属蛋白,参与铜离子转运至两个铜离子形成的CuA中心及细胞色素C氧化酶的亚基COX2生物合成的蛋白。作为参与铜离子转运的蛋白质,SCO1能够调节细胞内的铜离子平衡。但是,SCO1调节细胞内铜离子平衡的具体机制仍然不清楚。在本课题中,我们分别比较3种肥胖老鼠模型,ob/obmice,db/db mice,HFD mice与正常体重老鼠的肝脏组织,皮下脂肪组织,内脏脂肪组织中SCO1的表达情况。研究结果发现,不论是在mRNA水平还是在蛋白质水平,SCO1在肥胖老鼠的肝脏组织及脂肪组织中均较正常体重老鼠的相应组织中表达水平高,初步验证了上面两篇文章的研究结果,提示SCO1与肥胖密切相关。同时,SCO1在肥胖老鼠的心脏组织和棕色脂肪组织的表达水平也较正常体重老鼠的相应组织中表达水平高。目前关于SCO1的功能研究均与铜离子有关,而铜离子又是一种生命必须的微量元素,在调节代谢方面发挥重要作用。有文献报道铜离子缺乏的病人表现为血清或者组织中胆固醇增高及其他一些脂代谢的相应改变。而肥胖、2型糖尿病及一些心血管疾病中血清中胆固醇含量均是明显增高。这些疾病是否与铜离子的缺乏有关,目前并不清楚。临床流行病学调查数据显示,2型糖尿病病人的血铜和尿铜水平均较正常人要高。由于目前在人体的研究基本只能检测研究血液或者尿液中铜离子的水平,但是对组织中铜离子的含量暂时无法检测,所以可能血液或者尿液中铜离子的高水平恰恰掩盖了组织铜离子的缺乏。为了验证这种猜想,我们分别取正常老鼠及肥胖老鼠各个组织及血液尿液,运用ICP-光谱分析各个组织,血液及尿液中铜离子含量。结果发现,在血液及尿液中,肥胖组中铜离子较正常体重组要高,这个与流行病学调查中2型糖尿病病人的结果是一致的,但是在皮下脂肪组织,内脏脂肪组织,棕色脂肪组织,肝脏,心脏中,肥胖组中铜离子含量均较正常体重中要明显降低。以上结果验证了我们的猜想。进一步,我们构建了慢病毒载体表达的shRNA,注射入肥胖老鼠腹股沟脂肪垫,将局部皮下脂肪组织中SCO1敲低后,我们发现小鼠皮下脂肪组织的铜离子水平较对照组增高了28%左右,内脏脂肪组织,肝脏,心脏中的铜离子水平均较对照组升高了1-1.5倍不等。而相应的,血液和尿液中铜离子水平却显著下降,血液下降了3倍左右,尿液下降了2.5倍左右。上述结果提示,敲低SCO1可能导致机体铜离子发生了重新分布,铜离子重新进入了需要铜离子的器官中,而处于循环及排泄系统中的铜离子水平显著降低。我们在细胞水平过表达SCO1,然后用ICP-光谱技术检测细胞内铜离子的分布。研究结果显示,当SCO1过表达,细胞内的铜离子显著减少,细胞培液中铜离子明显增加。这说明SCO1的高表达会导致铜离子无法在细胞内停留,跟组织水平中SCO1高表达会导致整个组织水平铜离子相契合。同时,将肥胖皮下老鼠脂肪组织中SCO1敲低以后,检测发现血液中胆固醇含量得到明显改善,与文献报道铜离子缺乏导致肝脏及血液中胆固醇增高相互印证。体内许多酶发挥功能均需要铜离子的参与,比如Cu-ATPase,血浆铜蓝蛋白(CP)与Cu-Zn-SOD1等。其中,Cu-Zn-SOD1是机体抗氧化应激很重要的酶,如果铜离子缺乏,会导致其抗氧化供能减弱,氧化应激水平增加。而氧化应激是促进肥胖发生的重要因素。为了验证SCO1高表达是否会导致机体氧化应激水平增高,我们在细胞水平过表达SCO1,然后运用试剂盒检测ROS水平。结果发现过表达SCO1组ROS水平较对照组ROS水平明显增加。与之一致的是,肥胖老鼠中SCO1高表达的各种组织中,ROS水平也相应的高表达。当运用慢病毒载体表达的shRNA注射入肥胖老鼠皮下脂肪垫敲低SCO1后,皮下脂肪组织本身的ROS水平一定程度的被改善(ROS降低27%),这一结果与皮下脂肪组织铜离子本身只增加了28%相契合。相应的,铜离子水平明显增高的组织(内脏脂肪组织,肝脏,心脏),其ROS水平明显的改善,同时皮下脂肪组织的炎症水平也得到了一定程度的改善(炎症因子如MCPl,IL6,TNFa表达下降,抗炎因子IL10表达增加)。组织中ROS水平的增加,可能是铜离子缺乏使SOD1的酶活性降低,导致清除ROS的能力降低所致。如上所述,当运用慢病毒载体表达的shRNA,注射入肥胖老鼠皮下脂肪垫敲低SCO1后,运用试剂盒检测各个组织中SOD1的酶活性。结果发现铜离子改善的各个组织中SOD1的酶活性均明显增高。上述结果提示,SCO1敲低以后ROS的改善,是因为清除ROS能力得到了提升。为了排除皮下脂肪组织注射shRNA敲低全身各个组织SCO1表达的局限性,我们采用腹腔注射的方式,敲低ob/ob及db/db老鼠全身相应组织中SCO1的表达,在脂肪组织,肝脏及心脏中SCO1被敲低后,我们发现铜离子重新进入各个组织,血液及尿液中铜离子含量减少,缓解组织中铜的缺乏,提高组织的抗氧化能力,同时减少血液中胆固醇含量。这些结果与采取腹股沟注射shRNA敲低SCO1后的结果基本一致。我们的实验结果说明,在肥胖老鼠的脂肪组织及肝脏及心脏组织中,因为SCO1的异常高表达,铜离子不能正常进入细胞内,导致身体中的铜离子滞留于血液或者进入尿液中,无法进入真正需要铜离子的各个组织。铜缺乏导致需要铜离子的超氧化物歧化酶功能受到明显抑制,导致机体的ROS水平过多而引发炎症。并且铜离子的缺乏会导致血液中胆固醇增加。通过上述方式,SCO1促进了肥胖及相关代谢性疾病的发生。我们的研究工作揭示了SCO1在肥胖发生过程中的重要作用及其机理,将可能为肥胖及其相关代谢性疾病的治疗提供潜在的治疗靶点。肥胖主要是因为摄入食物超过消耗的能量,从而表现为脂肪组织增大。导致脂肪组织增大最直接的原因又分为脂肪细胞数目的增多和体积的增大,而脂肪细胞数目增多很大程度是由于脂肪细胞异常分化所导致。所以弄清脂肪细胞分化的分子机制,对于临床预防和治疗肥胖相关代谢性疾病有很重要的指导意义。前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞的过程由一系列复杂的转录因子调控,C/EBPp这个转录因子在此过程中扮演着重要角色。为了更深入了解C/EBPβ在脂肪细胞分化过程中的作用机理,本课题运用ChIP-on-chip技术筛选3T3-L1脂肪细胞分化早期受C/EBPβ调控的靶基因。结果筛选到一组自噬相关基因,Atg2a, Atg4b, Atg7, Atg9a,Atg10。用小干扰RNA将3T3-L1脂肪细胞中C/EBPP敲低后,只有Atg4b的表达水平受到明显抑制。进一步用ChIP-qPCR验证,结果显示C/EBPβ能够特异性结合到Atg4β的启动子区域上,且不能结合到其他几个自噬基因的启动子上。同时,运用点突变或者截断实验证明,C/EBPβ是通过结合在Atg4b的启动子转录起始位点上游6143至6130的区域从而调控Atg4b的表达。以上结果表明：C/EBPP通过结合到Atg4b这个靶基因的启动子特点区域上调控Atg4b的表达,从而调控脂肪细胞分化早期的自噬形成。Atg4b作为一种半胱氨酸蛋白酶,能够将LC3前体剪切生成LCI型,这个过程对于自噬泡的形成是必需的。我们运用siRNA将3T3-L1细胞中的Atg4b敲低,导致细胞内自噬过程明显被抑制,同时脂肪细胞的分化也明显被抑制。进一步采取敲低和挽救实验,利用鼠源siRNA将Atg4b敲低的同时,外转人源Atg4b质粒能够挽救脂肪细胞的自噬和分化过程,且挽救程度与外转Atg4b质粒的数量成正比。以上实验说明：C/EBPβ激活Atg4b表达不仅在3T3-L1细胞脂肪自噬形成过程发挥重要作用,对于脂肪细胞的分化过程也是必须的。自噬在脂肪细胞诱导分化的第2-4天之间有一个十分显著的增加,由于自噬通常降解胞内许多蛋白发挥其功能,我们猜测,自噬可能通过降解一些分化早期重要的抑制因子从而促进脂肪细胞的分化。为了验证这个猜想,我们检测了一系列抑制因子的降解过程,在加入自噬抑制剂3-MA后,3天收细胞检测,只有Klf2及Klf3的降解被明显抑制,其他抑制因子的降解均不受影响。加入泛素化途径的抑制剂MG132,并不能抑制Klf2及K1f3的降解。进一步应用siRNA将Klf2及Klf3敲低,显著挽救了加入3-MA或者siAtg4b对分化的抑制。以上结果表明：Klf2及Klf3通过自噬途径降解对于脂肪细胞的分化过程是必需的。p62作为一种自噬降解特异性的底物,文献报道其可招募多泛素化蛋白PML-视黄酸受体(RARa)到自噬泡降解,促进骨髓细胞的分化。p62在脂肪细胞分化过程中是否也发挥同样的作用?我们运用ChIP实验研究发现,p62与Klf2及K1f3在脂肪细胞诱导后第3天存在相互作用,而0-2天并不存在这种相互作用。p62是一种多泛素化结合蛋白,我们检测到Klf2及Klf3泛素化水平也是在第3天左右最高,这与p62主要在第3天与Klf2及K1f3相结合是一致的。p62与Klf2及Klf3结合后是否通过自噬途径降解?我们采用免疫荧光检测Klf2及Klf3与自噬泡的标志蛋白LC3的共定位。研究发现,GFP标记的外转Klf2及Klf3与LC3的确存在共定位,在3T3-L1细胞诱导4小时后敲低p62,这种共定位就不存在了,说明Klf2及Klf3与LC3的共定位是通过p62介导的。外转人源的p62质粒能够挽救siRNA将内源p62敲低后对Klf2与K1f3与LC3的共定位。如果将外转人源p62的LC3结合区域突变,就不能挽救内源p62敲低后对Klf2及Klf3与LC3的共定位缺失。以上结果说明：p62通过自噬途径降解K1f2及Klf3从而促进脂肪细胞的分化。为了印证以上实验结果在动物水平同样存在,我们用ChIP技术检测发现,在C57BL/6J老鼠的白色脂肪组织中,C/EBPβ同样结合到Atg4b的启动子上。重组腺病毒表达的shAtg4b注射入老鼠的一侧白色脂肪垫,另一侧注射重组腺病毒表达的LacZ作为对照,取组织western blot验证发现,注射shAtg4b能够抑制LC3的剪切和p62的降解,导致p62堆积,说明自噬过程受到明显抑制。和细胞水平一样,注射shAtg4b后,Klf2及Klf3的降解过程也明显受到抑制,PPARy及C/EBPa的表达明显增加。同时,整个脂肪组织明显变小。免疫组化分析发现其脂肪组织里的脂肪细胞体积变小,表明脂肪细胞里的脂滴减少了,同时脂肪组织中的脂肪细胞百分比也降低,说明脂肪细胞的分化过程受到了抑制。比较正常饮食喂养的C57BL/6J老鼠及用高脂饮食诱导的C57BL/6J肥胖老鼠,结果发现C/EBPβ, PPARr, C/EBPa, Atg4b及自噬水平均在肥胖老鼠脂肪组织高表达。这些实验结果与细胞水平实验结果一致。综上所述,我们的研究发现,C/EBPβ通过转录激活一个重要的自噬基因Atg4b,调节脂肪细胞分化过程中的自噬。自噬激活后通过p62介导方式特异性降解klf2及k1f3,从而保证分化过程的按时正常进行。同时,C/EBPp通过转录激活PPARγ和C/EBPα,两方面的协调效应促进脂肪细胞分化。本课题的研究中获得的实验结果,为我们提供了一种关于C/EBPβ功能的新见解,揭示了其在脂肪细胞分化中自噬形成中的分子机理。人为介入这个过程或许能够为治疗因脂肪组织的过度堆积导致的肥胖及相关代谢性疾病提供新的思路
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